边 界 病 研 究 进 展

王 莹，赵 明，王淑娟，徐天刚，刘雨田，格日勒图，吴晓东*，王志亮*

(1.内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.中国动物卫生与流行病学中心 国家外来动物疫病监测与研究中心，山东 青岛 266032；3.青岛市动物疫病预防控制中心，山东 青岛 266100)

1 边界病的发现与流行现状

边界病(border disease,BD)是由边界病毒(BDV)引起绵羊和山羊的一种病毒性疾病，呈世界性分布，英国、美国、日本、澳大利亚、加拿大和西班牙等许多养羊业发达的国家均有BD流行的报道，欧洲一些国家已经发现BDV可感染野生小反刍动物，我国也有关于本病的报道。1959年，BDV在英格兰和威尔士边界地区的羊群中被发现，研究后证实是由妊娠母羊感染BDV引起的，因为该病发现于边界地区，所以将其命名为BD。

1986年瑞典首次暴发BD，后续又暴发8起，其中有6起在与羊接触过的牛中分离到了病毒。瑞典暴发BD的原因是绵羊与牛混养引起的，而且牛病毒性腹泻黏膜病(bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD)持续性感染的牛是绵羊发生BD的重要危险因素[1]。1992年在新西兰暴发BD的羊场剖检病羊尸体有明显的黏膜病样病变[2]，相似的尸体剖检眼观病变使BVD与BD难以区分。同年的一项研究表明，绵羊在妊娠期感染BDV 1个月后的存活率可能低于正常出生的50%[3]。

2001—2002年(2-6月份)西班牙东北部地区的岩羚羊暴发了一种与BDV有关的疾病，此次暴发导致岩羚羊数目急剧减少42%。这是首次将BDV与野生反刍动物种群发生高死亡率疾病的暴发联系在一起，这对野生动物产生了重大影响[2]。欧洲一些国家，在高山牧场存在野生动物和家养动物经常共享放牧区域和水源，这种情况会加大动物疫病的传播风险。2004年在爱尔兰，对1 448只成年母羊的血液进行了BDV IgG1抗体检测，数据显示羊群的血清阳性率为6.3%～30.0%，而且血清阳性率在地理分布上存在差异，在东部和中部地区感染的羊群数量较多，而南部和西部较少。研究发现这与绵羊饲养密度和采用饲料槽进食有关，并且发病率高的牧场大多有牛羊混养现象[4]。2012年在我国安徽和江苏两省的腹泻山羊病例中首次分离出BDV，遗传进化树分析显示4株分离毒株与BDV-3属于同一分支，4株分离毒株之间的核苷酸同源性为87.7%～91.5%，与其他基因型BDV株的核苷酸同源性为75.7%～90.6%。对江苏省7个地区的BDV进行流行病学调查发现，各羊场血清阳性率为0%～67%；不同羊场BDV抗体阳性率不同，羊群自身的健康状态对病毒的抵抗力不同[5-6]。2014年在山东省外观无临床症状的羊群中也分离到了BDV，研究者在进行小反刍兽疫流行病学调查时提出活羊跨省运输频繁是跨省传播BDV的风险因素之一。2016年对西班牙南部野生和家养反刍动物采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和病毒中和试验(VNT)进行瘟病毒检测，结果显示羊场和牛场中BDV-4抗体滴度明显高于BVDV-NADL和BDV-1，BDV-4是西班牙BDV流行的主要基因型，病毒在牛羊间传播的可能性很大。

2 病原学

2.1 病毒的分类地位BDV与牛病毒性腹泻黏膜病病毒-1(bovine viral diarrhea/mucosal disease virus-1，BVDV-1)、BVDV-2 和经典猪瘟病毒 (swine fever virus，CSFV) 同属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，与丙型肝炎病毒同科[7]。基因组、抗原和血清学研究表明BDV与CSFV的关系比BVDV更密切。2017年，由国际病毒分类委员会(ICTV)的黄病毒科研究小组提出，BVDV-1、BVDV-2、CSFV和BDV这4种病毒分别更名为瘟病毒A、B、C和D。瘟病毒属还包括其他7个物种，分别是从瘟病毒E到K(图1)。

图1 基于Npro的完整核苷酸序列的瘟病毒属的系统发育分析和分类[8]

2.2 病毒分子结构BDV为直径 40～60 nm的有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒以出芽方式成熟。核衣壳呈二十面体对称，囊膜上有糖蛋白突起，膜的外表面呈放射状排列，呈螺旋对称。BDV长约12 300 bp，编码一个大的开放阅读框(ORF),在5′和3′末端具有小于400个核苷酸非翻译区(UTR)[9]。ORF编码一段大小约为3 900 bp的多肽蛋白质,在宿主和病毒蛋白酶的作用下可水解。

BDV基因组能够编码核衣壳蛋白C和3种包膜糖蛋白Erns、E1和E2[10]。另外还有8种非结构蛋白包括Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[11]。包膜糖蛋白E2和非结构蛋白Npro常用于病毒的遗传分类和系统进化分析[9]。目前通过病毒Npro基因可将BDV分为8个基因型(图2)。E2蛋白还可促使免疫系统产生特异性的BDV中和抗体,继而抵抗病毒的感染[12]。瘟病毒基因组的5′端UTR高度保守，除了包膜蛋白E2和非结构蛋白Npro以外，这段区域同样用于病毒分离株基因型的分类，而且常用于引物设计[8]。

图2 基于Npro蛋白基因完整核苷酸序列的BDV系统发育分析[8]

与BVDV相同，根据病毒的生长特性BDV可以分为细胞病变(cytopathogen，CP)和非细胞病变(non-cytopathogen，NCP)两种[13]。CP型是从宿主体内持续存在的NCP型中产生的，NCP型能够水平或垂直传播。绵羊胎儿一般在妊娠60～80 d内获得免疫力，研究表明80 d内感染CP型病毒会导致胎儿死亡，感染NCP型则会导致持续性感染(persistently infected，PI)动物的出生[14]。在山羊体内分离的BDV毒株大部分为 CP型，分离自PI绵羊的毒株则为NCP型[15]。但是，通过体外细胞培养得到的几乎所有BDV分离株都是NCP型。

2.3 BDV的发现1959年，在英格兰和威尔士边境地区报道了妊娠母羊表现出BD临床症状[2]。1972年首次提出致病病原可能是一种与BVDV密切相关的病毒，与CSFV有一定相关性。1977年，人们首次在细胞培养物中分离到BDV，同年利用免疫荧光法在冷冻切片中证实病毒抗原的存在。1998年，BECHER等[16]报道了第1个分离自绵羊的BDV全基因组序列，命名X818。

2.4 病毒理化敏感性BDV抵抗力不强，对脂类溶剂、紫外线和消毒剂敏感，对乙醚敏感性适中，病毒置于4℃乙醚环境18 h后病毒滴度明显下降。在50℃加热30 min，pH=3的酸性环境条件下可将病毒迅速灭活。

3 流行病学

3.1 自然宿主BDV的主要自然宿主是绵羊，山羊也可感染，某些品种的野生反刍动物也可感染本病。

3.2 持续性感染(PI)动物如果感染发生在胎儿获得免疫能力之前，并且胎儿存活将导致羔羊的持续性感染(PI)。新生羔羊可对BDV产生免疫耐受，但持续向外界排出病毒[17]。妊娠山羊感染BDV相对少见，主要症状表现为流产， PI羔羊是病毒在绵羊间传播的潜在主要传染源，而这种情况在山羊中比较少见[11]。

3.3 传染源病羊、PI羔羊和其他带毒动物是主要传染源。PI绵羊是最严重的传染源，一般认为，抗体阳性而无病毒血症的绵羊才是“安全的”。BDV主要存在于流产的胎儿、胎膜、羊水及PI动物的分泌物和排泄物中，所以饲养环境和垫草易被污染，动物通过吸入和食入污染物都可感染本病。PI公羊的精液也是主要的传染源。大部分地区BD的病原是BDV，但也有一些国家的病原是BVDV。牛的BVDV可以传染给绵羊，尤其要注意持续感染BVDV的牛不要与妊娠绵羊密切接触。另一方面，在活疫苗生产过程中，常见BDV污染，通过免疫被BDV污染的其他病活疫苗也会导致羊感染BDV[18]。

3.4 传播途径传播途径主要分为两种：垂直传播和水平传播。垂直传播是BD传播的重要途径。像其他瘟病毒一样，BDV可通过胎盘感染胎儿，致使胎儿死亡，母羊流产，甚至出现PI羊。PI绵羊的分泌物中带有感染性的病毒，可以不断向外界散播，通过喂食或口鼻接触这些直接接触方式很容易加速该病的水平传播。1981年报道了母羊因人工授精导致所生羔羊被感染的病例。截至目前，还未有虫媒传播本病的报道。

3.5 易感动物主要易感动物是绵羊和山羊，牛和猪也表现易感性[9]。BDV不是严格的寄主特异性病毒，它们可在不同偶蹄兽之间传播。许多野生动物也会感染本病，例如羚羊、骆驼、鹿、长颈鹿、河马、羊驼和羊驼等。

3.6 地理分布BD最初发现于英格兰和威尔士的边界地区。2012年初我国首次在安徽省和江苏省发生腹泻的山羊中分离到,证明了BD在中国的存在[6]。迄今为止，许多国家已分离到BDV(表 1)。

表1 BDV分离株基因型及地理分布

4 诊断

4.1 临床症状与病变BD主要表现为先天性感染，出生羔羊呈持续性感染。该病比较典型的临床症状是母羊不孕、流产和产弱羔等繁殖性疾病症状，病羊表现被毛粗乱，羊毛色素异常，骨骼异常及全身骨骼肌震颤等神经系统疾病(图3A)[19]，有些羔羊出现“骆驼腿”现象。在繁殖季节母羊难产或流产增多，流产可发生于妊娠的任何时期，流产母羊胎盘出现局灶性坏死性胎盘炎。长期感染BDV的羊会因为持续腹泻而导致肠道疾病(图3B)。病理变化主要以严重的髓鞘发育不良为特征。在组织病理学中，特征性病变的主要部位是中枢神经系统，表现大脑和脊髓的髓鞘发育不良，白质中细胞增多，神经胶质细胞形态异常。其他表现还有以神经胶质增生和血管周围单核细胞浸润为特征的非供血性脑膜脑脊髓炎，肺部表现间质性肺炎。典型病例还常有结节性动脉炎或动脉外膜炎。持续感染BDV后骨骼发现有骨硬化或骨质疏松样病变[3]。成年绵羊患病可能是暂时性的，一般在感染后30～40 d内可检测到血清转化[19]。

4.2 实验室诊断鉴定BDV感染动物可采用病毒分离鉴定、ELISA、琼脂糖凝胶免疫扩散试验(AGID)、血清中和试验、免疫组化(IHC)、原位杂交和反转录聚合酶链式反应(RT- PCR)等方法。诊断BDV PI羊最常用的检测方法是病毒分离鉴定、ELISA和qRT-PCR。世界动物卫生组织(OIE)针对BDV分离鉴定介绍了不同的血清学方法，基因组测序与系统进化树分析是目前世界上最常用的BDV分离株分型方法之一。其中病毒分离被认为是诊断的金标准。

图3 BD引起的神经症状及出血性肠炎[19]

4.2.1血清学诊断 血清学诊断广泛应用于确定畜群或地区中BDV的患病率，特别是在从未发生BDV的地区。抗体阳性结果就代表着外来BDV的侵入和流行。将感染的细胞作为抗原，利用血清中和实验、补体结合试验、AGID和ELISA等技术检测血清抗体。ELISA是比较有价值的筛选工具，适用于大规模样本的流行病学调查[20]。现在已有单克隆抗体捕获ELISA检测绵羊血清中BDV抗体。将单克隆抗体VPM22结合在96孔板上，在被洗涤剂溶解的BDV感染细胞中捕获抗原。然后将血清稀释液添加到含有结合BDV抗原的孔。单抗捕获阶段的加入能够提高ELISA的灵敏度[20]。江苏省农科院利用BDV主要免疫保护性抗原E2诱导IgG抗体产生，开发了BDV IgG抗体ELISA检测试剂盒[21]。瑞典Svanova公司已开发商业化的BDV特异性ELISA检测试剂盒可以对绵羊进行抗体检测[22]。为确保控制甚至根除疫病取得长期成功，应对偶蹄类动物中瘟病毒进行监测[3]。

4.2.2病原学诊断 酶联免疫吸附试验、反转录聚合酶链式反应、荧光定量PCR和免疫组化等均可用于鉴定BDV感染动物。PI绵羊组织中病毒含量高，比较适合病毒分离和鉴定，但是出生两个月以内的羔羊获得母源抗体会干扰检测结果，特别是病程为急性感染时，病毒血症较短暂，检测也比较困难。目前，比较广泛使用qPCR和RT-PCR方法检测血液、组织和拭子等多种临床样本中BDV病原[18]。

5 经济社会影响

在很多地区，很多养殖户不了解这种疾病，并且很大程度上低估了BDV对小反刍动物的危害。BDV可引起母羊流产和不孕，而且会产下PI羔羊，这对养羊业的健康发展有着相当大的影响。虽然BDV通常被认为是羊病，但有许多文献记载该病毒可以交叉感染多种偶蹄兽[23]。活动物交易也是该病传播的主要危险因素之一[24]。

6 预防与控制

6.1 鉴别诊断BDV与布病和赤羽病等都有着相似的临床症状，需要与其他临床症状相似的生产性疾病进行鉴别，对发病动物做出准确诊断。最易混淆的还是同科同属的BVDV。经典和实时RT-PCR都可用于检测BDV和BVDV，然后通过阳性样品测序进行基因分型。与BVDV不同，IHC中没有检测BDV的可靠抗体。在牛、羊群体中，可以将对识别瘟病毒的通用抗体与BVDV特异性抗体结合起来进行检测，对瘟病毒反应的抗体表现阳性，而对BVDV特异性抗体表现阴性即判断为BDV感染。巢式PCR也可以区分BVDV-1、BVDV-2和BDV这3种反刍动物瘟病毒，根据这3种病毒序列同源性设计与瘟病毒其他区域没有同源性的引物，再使用特异性引物对共有PCR产物进行第2次PCR即可对BVDV-1、BVDV-2和BDV进行鉴别[25]。

6.2 开发安全有效的BDV疫苗目前没有针对BDV的商业化标准疫苗，但已开发和销售了一种全病毒灭活疫苗。而报道称细胞培养传代CP型 Moredun毒株制成的弱毒疫苗也具有一定的保护力[26]。免疫时，必须在母羊配种前接种BDV灭活疫苗，以防止后续胎盘感染。同时也要考虑疫苗株与流行毒株之间的差异。有研究者建议使用BVDV疫苗进行免疫，但必须考虑到的是BDV具有抗原多样性差异。经验证明，感染母羊在连续的2～3个妊娠期都会产出病羊，但是病情会有所减轻。GARDINER等[3]发现，人工感染BDV的母羊，在1年后再用同样的病毒攻击，母羊可表现抵抗力。由于没有商用BDV疫苗可用，目前对BDV的防控局限于鉴别诊断，保护易感动物以及消除PI动物等方面。对于BDV能否产生特异性免疫目前还有争论，理想的疫苗必须能够有效阻止病毒通过胎盘传播。

6.3 加强饲养管理，消灭PI动物，做到物种间隔离饲养等综合防控目前还没有有效针对BDV的药物和治疗方法，控制本病主要采取综合防控的措施。若发现畜群感染BDV，必须及时淘汰病畜及其所产的幼畜，并对养殖环境严格消毒。兽医相关部门要加强兽医卫生监督管理，加强口岸检疫，严格检测引进物种，引入后隔离饲养4～5周再混群。禁止在BDV流行的国家和地区引进种羊。病原体在野生动物和家畜之间的传播已成为一个日益关注的全球性问题，养殖户也要做好自身的防范工作。加强饲养管理，坚持自繁自养，保证饲料营养均衡，定期消毒圈舍，若发现有疑似症状，及时隔离或扑杀病畜，并上报到相关部门。欧洲很多BDV疫情的暴发都是因为牛羊混养引起，为预防BDV在物种间相互传播，尤其是在繁殖季节，BD感染率显著上升，因此要避免羊只与其他动物混合养殖。控制BD传播的另一个关键是在早期预防胎儿感染。PI动物是最严重的的传染源，早期检测病毒以及消灭PI动物对成功控制BDV至关重要。

综上所述，BDV是公认影响经济发展的重要动物疫病，但目前欧盟尚未制定BDV控制计划，我国也未出台相应的防控标准。BD母羊流产，产下PI动物等问题都会对畜牧经济产生极大的损失，我国应对BDV引起足够重视。BD与许多动物疫病都有着相似的临床症状，准确辨别疫病种类是疫病防控的关键。通过严格饲养管理，加强生物安全管理水平，及时对疑似染病动物特别是持续性病毒血症PI绵羊的检测和淘汰是综合防治本病的重要措施。通过早发现，早诊断，及时消灭传染源，切断传播途径和保护易感动物等，达到预防该疫病的目的。