长柱型日本蛇根草花冠筒内横生绒毛作用探究

相孟达，严 洁，李 玉，邓 伟，聂雪婷，汤晓辛

(1.贵州师范大学 西南喀斯特山地生物多样性保护国家林业和草原局重点实验室，贵州 贵阳550001；2.贵州师范大学 贵州省植物生理与发育调控实验室，贵州 贵阳550001；3.贵州师范大学 生命科学学院，贵州 贵阳550001)

日本蛇根草(Ophiorrhizajaponica)，茜草科蛇根草属植物，对生长环境要求较低，广泛分布于广西、贵州、云南等地[1]。通过超声波提取技术、超临界流体萃取等中药提取新技术[2]，可有效地从中提取出喜树碱等抗癌物质[3]，具有较高的开发价值。探索影响日本蛇根草繁殖方式的因素，有利于合理开发该种植物。

野生植物的进化过程是不断适应环境，完成生存繁衍的过程，被子植物长期进化过程中形成的花多样性[4]，其不同的结构与功能在对植物生殖过程不同阶段产生不同程度的影响，被认为是被子植物进化成功的原因之一[5]。

某些植物在长期适应环境的过程中形成特殊花部结构或附属物[6-7]，通过特化的结构提供新的机会[5]，从而提高繁殖成功率。一些植物会使用“伞”或表面疏水性结构保护花粉不被打湿[8]。在武汉地区进行的植物花粉保护结构对植物生殖影响的实验中发现，具有花粉保护结构的植物通过隔离花粉与外部雨水影响花粉活力[9]；松香科植物花瓣上伴有附属物，能分泌油脂，散发气味吸引传粉者[10]；眉兰属唇瓣形态与雌性泥蜂相似，具长红毛，能分泌特殊气味吸引雄蜂进行假交配而达到传粉目的[11]；毛茛科植物二唇形花瓣使蜜腺隐藏更深，增加传粉者取食难度，延长传粉者的停留时间从而提高传粉效率[12]。

在前期进行日本蛇根草传粉实验时，发现长柱型花筒内具有横生较长的白色绒毛覆于花药上方，短柱花则无。对于这种附属于花瓣的特殊结构对植物生殖过程的影响，目前国内外研究较少。为进一步探究该绒毛结构在日本蛇根草繁殖过程中发挥的作用，我们进行了针对性的试验。

1 试验材料

1.1 研究物种与试验地点

日本蛇根草是一种多年生草本植物，常生于常绿阔叶林下的沟谷沃土，花期冬春，花二型，花柱异长(图1)。其中长柱型花筒内部有一圈横生且较长的白色绒毛，且绒毛恰好覆于雄蕊上方，而短柱型则无白色绒毛(图2)。试验时间为2020年1月，地点位于中国西南部施秉县黑冲地区施秉云台山(108°7′E，27°9′N)。

图1 日本蛇根草不同柱型花朵A为长柱型，B为短柱型Fig.1 Flowers of different style types in O.japonica.A is long style type,B is short style type

图2 日本蛇根草长柱型、短柱型花及结构Fig.2 Long style and short style flowers of O.japonica and their structures注：A、B为长柱型；C、D为短柱型

2 试验方法

2.1 前期处理

在实验开始前选择大量即将开放的长短柱型花苞，套袋后用挂牌做上标记，记录日期等，以备后期各项实验研究。

2.2 植物性状测量

采用卷尺和游标卡尺测定了蛇根草两种不同柱型的主要植物性状，例如株高、叶片长宽、花筒深度、花筒直径、花朵长宽、花朵开口长和宽、花瓣长和宽、雄蕊长度、雌蕊长度，花药的长、宽、厚，柱头的长、宽、厚等。测定样本为60个(长柱型和短柱型各30个)。

2.3 不同柱型花朵对自然温度变化响应

先将部分长柱型花筒中的长绒毛利用解剖针小心去除，做上标记，再将同区域未做处理的长柱型和短柱型做上标记(图3)。然后利用热成像仪(FLIR T650sc)连续5天于上午11～12时左右，分别对去除绒毛长柱型花、未处理长柱型花、短柱型花进行热成像拍摄。拍摄得到的照片用FLIR Tools处理。

图3 A为未处理长柱型，B为去除绒毛后长柱型Fig.3 A is the untreated long style type,B is the long style type after removing the pubescence

2.4 不同柱型繁育系统研究

2.4.1 花粉活力测定

采用TTC染色法进行花粉活力的测定[13]。(1)配制磷酸缓冲液：取0.78025 g的NaH2PO4·2H2O溶于50 ml双蒸水中配成溶液甲；取1.791 g的Na2HPO4·12H2O溶于50 ml双蒸水中配成溶液乙。取19.5 ml溶液甲和30.5 ml溶液乙混合即成。(2)不同浓度TTC溶液配制。0.1%TTC溶液：称取0.01 g氯化四唑粉剂溶解于10 ml磷酸缓冲溶液，其他浓度TTC溶液均按此法根据不同比例配制。选用0.5%的TTC溶液对开放第一天至第六天的不同柱型的花粉进行染色。不同开放天数每种柱型均采取10～15个样本，取下花药，常温下遮光染色12 h，并置于普通光学显微镜下观察(染上红色的花粉即为有活力花粉)，统计每个视野中红色花粉比例，每个样本统计5个视野。

2.4.2 柱头可授性检测

做花粉活力测定的同时，用镊子取下柱头，通过联苯胺-过氧化氢法进行不同柱型的柱头可授性检测[14]。从之前标记的花苞中选取不同开放天数的花朵，从开放第一天至开放第六天的长短柱型花中均选取15～20朵，取下新鲜柱头，置于载玻片，滴上一定量联苯胺-过氧化氢溶液，置于普通光学显微镜下观察，有气泡连续冒出，则视为柱头有活性。

2.4.3 浸水不同时长花粉活力测定

采同开放时期的长短柱型花，取花药，分别在蒸馏水中浸泡2 h、3 h、4 h，再分别用0.5%TTC溶液进行染色(样本量及染色方法、统计方法与上文同)。

2.4.4 不同柱型自交亲和性

2018年冬至2019年春，曾在同区域进行日本蛇根草的传粉生物学实验，对不同柱型的日本蛇根草进行过人工授粉，包括自然(除吊牌标记外，不做其他处理)，自交(用之前标记的套袋里的花做自交授粉处理，再将套袋套回，挂上吊牌)等。

2.5 数据分析

实验中得到的数据均用IBM SPSS Statistics 22进行平均值和标准误的差异性比较分析。

3 结果与分析

3.1 植物性状

如表1所示，长柱花和短柱花的花筒直径呈显著性差异，雄蕊长度、雌蕊长度呈显著性差异，花药长、宽、厚，柱头长、宽、厚呈显著性差异，其余各项植物性状差异不显著(表1)。

表1 日本蛇根草植物性状Table 1 plant traits of O.japonica

3.2 不同柱型花冠筒区域温度变化

连续5天在同区域同时段对长柱花朵、短柱花朵、去绒毛长柱花朵进行热成像拍摄，同时对长柱花、短柱花、去除绒毛后长柱花的温度进行了对比。结果表明，长柱花花筒区域温度连续5天内均高于去除绒毛后长柱花花筒区域温度，且差异性显著；长柱花与短柱花相比，在第3天，短柱型花筒区域温度高于长柱型，差异显著，第4天，短柱型稍高于长柱型，差异不显著，其余时间则为长柱型高于短柱型且差异显著(图4)。

图4 长短柱型及去绒毛长柱型花筒区域热成像温度变化图(仅组内比较分析)Fig.4 Thermal imaging temperature variation of long and short style and Long style with pubescence removed(intra group comparison analysis only)

3.3 两种柱型花粉活力

研究结果表明，长柱型和短柱型花粉均在花朵开放第2天时活力最强，但无显著性差异。长柱型从花朵开放第5天往后，花粉活力急剧下降，而短柱型则从第3天开始花粉活力就急剧下降。长柱型花粉活力整体趋势高于短柱型，从第3天开始两者花粉活力呈现显著性差异(图5)。

3.4 两种柱型柱头可授性变化

结果显示，从开放第1天至第3天长短柱花的所有柱头均具有可授性，但从第3天起，长短柱型的柱头可授性均开始下降(图6)。

3.5 浸水不同时长花粉活力变化

结果显示，浸水2 h后长短柱型花粉活力相近，无显著性差异；浸水3 h后，长柱型花粉活力仍较强，短柱花花粉活力则急剧下降，呈现显著性差异；浸水4 h后，长短柱型花粉活力均较弱，下降至20%以下，呈现显著性差异(图7)。

3.6 两种柱型不同授粉处理结果

根据日本蛇根草传粉生物学试验结果，发现在自然状态下和人工控制进行自交情况下，长柱型的自然和自交处理所得种子数均显著高于短柱型(图8)。

图5 长柱型、短柱型花粉活力变化Fig.5 Changes of pollen vitality of long and short style type

图6 不同柱型日本蛇根草柱头可授性变化Fig.6 Changes in stigma receptivity of O.japonica with different style types

图7 不同柱型花粉浸水不同时长后花粉活力变化Fig.7 Changes of pollen viability of different style types pollen after soaking for different time

图8 不同柱型日本蛇根草不同授粉处理种子数Fig.8 The number of seeds obtained by different pollination treatments with different style types

4 讨论

植物特殊花部结构会对植物生殖过程产生影响[10]。研究表明日本蛇根草花柱异长，长短柱两种类型的花筒直径，柱头和花药长、宽、厚有显著性差异，长柱型花筒内具白色绒毛，短柱型无，其余花部形态特征均无显著性差异，能对日本蛇根草生殖过程产生影响的花部特征，可能为花柱长短和特殊绒毛的有无。

生长温度对花粉活力产生较大的影响[15],生长在适温下的花粉活力高[16-17]。这在进行花粉活力测定时得到证实，长柱型花粉活力总体较高，短柱型活力较低，而且长柱型的较高的花粉活力能维持相当一段时间。热成像仪检测温度变化的实验结果表明，长柱型的绒毛结构具有保温作用，结合试验的时间是在1月份，温度较低，这一结果也说明绒毛保温作用对花粉的保护。

花粉浸水实验显示出长柱型花粉具有较强的耐水性，该现象似乎与前人研究中关于“具有保护结构的花粉耐水性较弱”的结论相反[9]，然而这是可以解释的，在成功授粉前许多因素会影响花粉命运[18]：首先是花粉的移出，长柱型花药包裹在花筒中，一定程度上影响了花粉被传粉者移出，降低了繁殖成功概率，因此长柱型耐水性较高可减小此结构负面效应；其次是花粉的落置和花粉管的萌发，大多数的自交不亲和机制不能防止植物的花粉落到自己的柱头上[19]。有多项研究表明，自花粉在堵塞柱头或以其他方式干扰异交花粉时，会对适应度产生负面影响[20-22]，植物防止自交的一种常见方式是在同一朵花中通过时间和空间分离花粉和柱头[19]。在自交亲和性实验中长柱型自交亲和性显著高于短柱型。日本蛇根草开放第一天即具有较高的花粉活力和柱头可授性，在时间上的分离不太明显，而长柱型的绒毛结构则在空间上实现了分离(图5和图6)，因此也可以看出长柱型抵消自交亲和性高的负面效应的进化特征，短柱型无此结构则花粉更容易落至自己柱头(图2)，所以短柱型具有自交亲和性较低的进化特征。

试验在验证日本蛇根草(长柱型)绒毛结构对其生殖方面影响的同时，也为探索花部特征进化的动力提供了一些证据。花部特征的塑造由生物和非生物因素共同完成，在前人进行的研究中认为传粉者介导的选择，推动了花部特征多样化和相关特征共同进化[23-28]，特化的植物中，这种作用表现的更加明显。但传粉者介导的特征选择不能解释所有的花部特征分化[29]，植物对一些非生物因素的适应，如干旱[30]、温度[31]、水[32]等，同样介导了花部特征的分化。而花部特征的分化，特别是一些较为特殊的花部结构，又通过在植物生殖过程的不同阶段或不同方面发挥作用，影响植物的繁殖以及演化方向。从试验结果看，长柱型日本蛇根草的绒毛结构具保温作用，从而影响植物花粉活力，使长柱型蛇根草的花粉活力高于短柱型；长柱型花粉的耐水性强于短柱型；而且其自然、自交的繁殖成功率也显著高于短柱型。这些证据不仅有助于植物繁殖与进化的研究，也为日本蛇根草的保护与开发提供了重要的理论参考。