不同采收期大接骨丹HPLC 指纹图谱建立及化学模式识别

韩忠耀 ，张 涛 ，李 燕，胡志平，陆廷祥，王传明，王玉明，王应肃

（1.黔南民族医学高等专科学校，贵州都匀 558000；2.天津中医药大学，天津 300193）

大接骨丹来源于山茱萸科植物有齿鞘柄木Toricellia Angulata Oliv.var. intermedia（Harms）Hu 的根皮，别名水冬瓜根皮、水五加等［1］。当前，针对大接骨丹的研究，主要集中在有效成分的分离与鉴定［2-5］、抗炎镇痛药效［6］、免疫抑制活性［7-8］、病虫害种类及野生资源破坏情况调查［9］、提取工艺优化［10］以及质量控制［11-14］等，尚未见对黔产不同采收期大接骨丹HPLC 指纹图谱的研究。本实验首次针对黔产不同采收期大接骨丹建立HPLC 指纹图谱，并结合相似度评价、聚类分析、主成分分析、正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）等化学计量学统计分析软件，对不同采收期大接骨丹进行质量评价，以期为从整体上控制其质量提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪（DAD 检测器，美国Agilent 公司）；FA1004B 型电子天平（温州瑞昕仪器有限公司）；101-3AB 型烘箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；HH-S8 双列八孔水浴锅（常州迈科诺仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 紫丁香苷对照品（北京盛世康普化工技术研究院，批号161214）；乙腈（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司，批号20160504）；磷酸［分析纯，重庆川东化工（集团）有限公司，批号20140201］；水为娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司，批号20180407）；其他试剂均为分析纯。大接骨丹药材自采于贵州省都匀市杉木湖沟渠（生长环境为露天向阳山坡、沟渠，周围榜流动溪水，黄壤土，伴生植物主要有芭茅、囊吾、肾蕨、及己、三叶鬼针草等），经黔南民族医学高等专科学校药学系王传明副教授鉴定为山茱萸科植物有齿鞘柄木Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia（Harms）Hu 的根皮，信息见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agela Promosil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.5% 磷酸水（B），梯度洗脱（0～10 min，9% A；10～20 min，9%～14.4% A；20～25 min，14.4%～18%A；25～45 min，18%～21.5%A；45～60 min，21.5%～70% A；60～60.1 min，70%～9% A；60.1～70 min，9%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温35 ℃；检测波长230 nm；进样量5 μL，保留时间为70 min。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 取紫丁香苷对照品，精密称定，置于量瓶中甲醇溶解，摇匀，得0.172 0 mg／mL 的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 自采的鲜药材50 ℃下烘干，粉碎后过4 号筛，装入自封袋，贴标签后备用。分别称取各采收期内药材粉末，每份约0.5 g，精密称定，置250 mL 圆底烧瓶中，精密加入用甲醇50 mL，回流提取1 h 后，放冷，滤过，用甲醇补足每份滤液为50 mL，摇匀。各滤液分别经0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一批（G6）供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，连续进样6 次，测得各共有峰相对保留时间RSD 均小于2.15%，各共有峰相对峰面积RSD 均小于1.09%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同一批（G6）供试品6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，测得各共有峰相对保留时间RSD 均小于1.31%，各共有峰相对峰面积RSD 均小于2.63%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一批（G6）供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别于0、4、8、12、24、36、48 h进样，测得各共有峰相对保留时间RSD 均小于0.97%，各共有峰相对峰面积RSD 均小于2.44%，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.4 指纹图谱建立 取11 批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，将AIA 格式图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723 版本），以G6 为参照图谱，以“中位数”生成对照图谱，时间宽度为0.1，得到11 批样品HPLC 指纹图谱，见图1～2。以共有峰2（S）紫丁香苷为参照峰S，计算14 个共有峰的相对保留时间和相对峰面积，见表2～3。14 个共有峰的相对保留时间的RSD 均＜3.00%，而共有峰的相对峰面积的RSD 值波动较大，除参照峰2（S）外，在37.22%～134.07%，表明不同采收期内大接骨丹二次代谢产物积累呈显著性差异。

图1 不同采收期大接骨丹对照品图谱

图2 11 批不同采收期样品HPLC 指纹图谱

表2 11 批不同采收期样品共有峰相对保留时间

表3 11 批不同采收期样品共有峰相对峰面积

2.5 化学模式识别

2.5.1 相似度评价 利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723 版本），全峰匹配模式，以中位数生成对照指纹图谱后，利用该软件计算其相似度，结果表明，不同采收期大接骨丹与对照图谱相似度在0.911～0.997，见表4。

表4 11 批不同采收期样品相似度

2.5.2 聚类分析 以14 个共有峰相对峰面积导入SPSS 18.0 统计学软件，采用组间均联法，以欧式平方距离为分类依据，进行系统聚类，不同采收期大接骨丹聚类分析结果见图3。结果表明，当分类距离为25 时，聚类分析将11批不同采收期大接骨丹药材分为2 类，其中G8 单独聚为第一类，其他批聚为第二类。当分类距离＜3 时，G1～G11 分别对应样本采集月份，发现G4、G5、G6、G7 为一小类，G1、G3 为一小类，G9、G10、G11、G2 为一小类，G8 单独为一类，从聚类分析可以看出，虽然不同采收期内相对峰面积RSD 差异性较大，但是不同采收期大接骨丹质量相对稳定、可控，这与相似度结果基本一致。

图3 11 批不同采收期样品聚类分析树状图

2.5.3 主成分分析和正交偏最小二乘法-判别分析 参考文献［15-16］，将14 个共有峰相对峰面积作为变量，导入SIMCA-P+12.0 在软件自动拟合求解后，进行主成分分析和OPLS-DA 分析，结果见图4～5。主成分分析结果显示，G8 样品主成分分析得分较高且G8 偏离图4 中心点最远，与其他批呈显著性差异，该结果与聚类分析结果基本保持一致。OPLS-DA 分散点图验证了主成分分析与聚类分析结果，1 组与2 组区分结果较好。同时，14 个共有峰相对峰面积的VIP 值顺序依次为峰3、13、4、7、11、9、12、8、7、6、14，结果显示峰3、13、4、7、11、9、12、8 共8 个共有峰的VIP 值大于1，峰5、10、1、7、6 共有峰VIP 值均大于0.7，峰14 VIP 值均大于0.4。VIP 结果表明峰3、13、4、7、11、9、12、8 对不同采收期样品的分类具有显著性影响，为其主要化学成分质量标志物，可用于其质量控制的关键性二次代谢产物指标性化学成分。

3 讨论

图4 11 批不同采收期样品主成分分析得分散点图

图5 11 批不同采收期样品OPLS-DA 得分散点图

本实验在预实验时，考察了不同提取溶剂、提取方法、色谱柱、流动相等条件，发现流动相0.5%-磷酸水显著优于0.5%-醋酸水。不同采收期大接骨丹在230 nm 时，样品吸收峰较多，且分离度较佳，最终确定了“2.1”项下条件。

采集样品时，根据采集年份不同采收期大接骨丹地上部分生长趋势，采取单月的月中采集1 次或单月的10 日、20 日采集2 次。相似度评价时，与4 至12 月份样本相比，发现1 至3 月份相似度较低，可能与当年当地气候或过冬气候节令有关。采集样品当年，大接骨丹较往年3 月份地上部分开始萌芽推迟近1 个月，4 月初地上部分开始萌发新芽。结合生产与用药实际，建立了适应谱相对较宽的4至12 月样品HPLC 指纹图谱，有利于药材的质量控制。气候等外部环境对大接骨丹二次代谢产物积累规律，有待进一步深入研究。

本研究利用HPLC 技术与指纹图谱质量控制技术，建立不同采收期内黔产大接骨丹HPLC 指纹图谱，同时，利用相似度评价、聚类分析、主成分分析、正交偏最小二乘法-判别分析等化学计量学技术，对黔产不同采收期大接骨丹的质量进行客观性评价，以期为该药的质量控制、资源开发、少数民族聚集地民间用药及民族医疗机构或中医院临床用药提供参考。