贵州武陵片区不同种植年限设施菜地土壤微生物群落的结构和功能多样性

赵 辉，王喜英 ，徐仕强，谭智勇

(铜仁学院 经济管理学院，贵州 铜仁 554300)

武陵山区包括湖南、湖北、重庆、贵州四省的71个县(市、区)，其中，贵州片区人均GDP水平低于重庆、湖南和湖北三省，是国家扶贫工作的重点区域之一[1]。随着国家投资力度加大，该区域设施蔬菜种植面积和规模不断扩大，在实现农村经济发展和农民增收方面起到了重要作用。然而，在设施蔬菜种植过程中，由于种植者缺乏有效的经营管理措施，普遍施肥过量，导致土壤质量逐渐退化，蔬菜品质下降严重，不利于设施蔬菜高效持续发展[2-3]，在一定程度上对该区域农业增产、农民增收、生态环境安全产生不利影响。

土壤微生物在推动土壤养分转化与维持、物质循环、能量流动中发挥着重要作用[4-6]。随着设施蔬菜种植年限延长，过量施肥会造成土壤养分富集，导致土壤次生盐渍化及酸化现象严重。相关研究认为，土壤理化性质如土壤颗粒大小、通气性、pH值、有效氮含量对土壤微生物活性及群落结构有重要影响[7-10]。由此可知，土壤微生物群落结构及多样性在不同种植年限设施菜地土壤中差异较大。在设施蔬菜种植过程中，土壤微生物群落结构随土壤质量发生同步变化，进而可以反映土壤质量受损程度[11]。鉴于土壤微生物群落对设施土壤环境变化的敏感性，可以作为设施菜地土壤质量变化的重要预警指标之一[12]。因此，及时有效地监测土壤微生物及功能群变化，可为实现退化土壤恢复及提高设施蔬菜高效持续经营提供科学依据，对揭示不同种植年限设施蔬菜引起土壤质量退化的微生物学机制具有重要意义。

鉴于设施蔬菜种植对促进当地经济发展和提高人们生活水平方面的重要性，如何维持设施蔬菜高效经营已经成为学者及种植户关注的焦点。目前，关于不同年限设施蔬菜土壤的研究主要集中在土壤机械组成[13]、土壤养分[14]、酶活性[15]、次生盐渍化[16]、微生物功能多样性[17]等方面，研究区域主要集中在山东[18]、江苏[19]、北京[20]等省市。然而，关于武陵片区不同种植年限设施菜地土壤微生物群落结构及功能多样性的研究未见报道。为此，利用磷脂脂肪酸(PLFAs)、Biolog技术，对贵州武陵片区不同种植年限设施菜地土壤微生物群落结构及功能多样性进行研究，旨在探讨不同年限设施菜地土壤微生物群落变化规律、土壤环境因子与微生物群落之间的关系，从微生物角度来分析设施土壤质量退化原因，同时为缓和设施菜地土壤质量衰退和促进武陵山区设施蔬菜高效健康持续发展提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验样地

研究区位于贵州省铜仁市和平乡(109°07′44″E，27°46′46″N)，属亚热带季风气候，年均温18 ℃，年降水量1 313 mm，土壤类型为黄壤。于2017年7月选择3个不同种植年限(3、5、7 a)设施蔬菜大棚为处理，以周围种植的露天蔬菜为对照(CK)，主要种植茄子、黄瓜、西葫芦、豇豆等。设施蔬菜基肥施用氮磷钾复合肥1 200～1 500 kg/hm2，追施氮肥600～750 kg/hm2。露天菜地施用氮磷钾复合肥600～750 kg/hm2，追肥300～450 kg/hm2。大棚规格为长×宽(8 m×40 m)，每个处理设置3个重复，样地内按S形(5点法)采集0～10 cm土壤样品，混合成1个土样，用低温冰盒保存并迅速带回实验室。土样在室内去除石块、植物根系并过2 mm孔径筛后，分为3份，1份4 ℃冰箱保存，用于微生物生物量碳、氮含量Biolog-Eco测定；1份-80 ℃冰箱保存，用于PLFAs含量测定；1份室内风干，用于土壤化学性质测定。

1.2 土壤理化性质，微生物量碳、氮含量测定

1.3 PLFAs类群和含量测定

PLFAs含量测定采用修正的BLIGH等[23]的方法。称取相当于8 g烘干土的新鲜土样，加入磷酸缓冲液30 mL，甲醇∶氯仿(体积比2∶1)105 mL混合液振荡2 h后，分别加入氯仿36 mL、无菌水36 mL，避光浸提18～24 h。有机相过滤、浓缩，利用固相萃取技术，通过SPE固相萃取小柱(Bond elute，167 mg/mL)进行脂肪酸分离，氮吹仪浓缩后，加1 mL 0.2 mol/mL的氢氧化钾甲醇溶液，37 ℃加热15 min进行甲基化。加内标液(十九碳酸甲酯)0.5 mL，用气相色谱-质谱(GC-MS)分析。用MIDI系统操作气相色谱火焰离子化检测器(GC-FID)，后续PLFAs含量及类群分析均由MIDI Sherlock微生物鉴定系统完成。根据文献对不同微生物的PLFA进行标记[24-25](表1)。

表1 表征微生物的PLFAsTab.1 PLFAs characterizing microbes

1.4 土壤微生物群落功能多样性测定

采用含有31种碳源底物的Biolog-Eco微平板分析微生物群落的碳代谢特征，即功能多样性。Biolog-Eco微平板有96个孔，31种碳源。微平板上的31种碳源可划分为六大类，包括碳水化合物类(10种)、氨基酸类(6种)、聚合物类(4种)、羧酸类(7种)、酚类(2种)、胺类(2种)。其中，每类碳源包含的所有单一种碳源的平均颜色变化率(AWCD)之和即为土壤微生物群落对该类碳源的利用能力。

称取相当于10 g烘干土的新鲜土样，加入无菌生理盐水，振荡30 min后于4 ℃下静止10 min，然后吸取1 mL原液于9 mL无菌生理盐水中，摇匀后用多通道移液器取150 μL提取液，加入到生态板的每个孔中，每样1板，每板3次重复。然后在20 ℃下培养，每24 h在Biolog-Eco读数仪读取590 nm下的吸光值，连续培养192 h。土壤微生物代谢活性用每孔AWCD值描述，计算公式如下：

AWCD=∑(Ci-R)/n

式中，Ci为各反应孔在590 nm下的吸光值；R为对照孔的吸光值，n为碳源底物种类，n=31；(Ci-R)<0的孔在计算中记为0。本试验利用各样品培养96 h后的数据，计算土壤微生物群落功能多样性指数：香农(Shannon)指数、辛普森(Simpson)指数、均匀度(McIntosh)指数，计算公式如下:

Shannon指数H=-∑(Pi×lnPi)；

Simpson指数D=1-∑(Pi)2

式中，Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)表示第i孔的相对吸光值与整板平均相对吸光值总和之比。

1.5 数据处理

采用SPSS 21.0统计软件，通过单因素方差分析( One-way ANOVA，n=3，P<0.05)和多重比较检验土壤化学性质、微生物量碳、氮含量，PLFAs含量、微生物群落结构代谢功能多样性指数差异显著性(P<0.05)；微生物群落结构功能多样性指数、6大类碳源与土壤化学性质之间的相关性分析采用SPSS 21.0和R软件完成；微生物群落结构层次聚类分析、主成分分析(Principal component analysis，PCA)、冗余分析(Redundancy analysis，RDA)用R软件完成。

2 结果与分析

2.1 土壤特征

由表2可知，土壤pH值为4.53～6.22，随设施蔬菜种植年限延长呈逐渐降低趋势，均显著低于CK，土壤酸性逐渐增强。不同设施蔬菜种植年限土壤全氮、速效磷、铵态氮、硝态氮含量均高于CK。全氮、铵态氮、硝态氮含量随种植年限延长而增加，其中,各种植年限的铵态氮、硝态氮含量均与CK差异显著。种植年限3、5、7 a的土壤速效磷含量分别是CK的2.09倍、1.62倍、2.27倍。速效钾含量随种植年限延长而递减，各种植年限均与CK差异显著。土壤有机碳含量、C/N随种植年限延长逐渐降低，均显著小于CK。各处理土壤微生物量碳含量均高于微生物量氮含量。种植年限3 a土壤微生物量碳、氮含量均最高，分别为360.64、108.72 mg/kg，分别比CK高出74.51%、4.17%。种植年限5、7 a的土壤微生物量碳、氮含量均显著小于CK，且5、7 a之间差异不显著。

表2 不同处理土壤特征Tab.2 Soil characteristics with different treatments

2.2 PLFAs类群和含量

由表3可知，4个处理土壤中共有17种PLFAs被标记到不同微生物类群。土壤微生物PLFAs总量、细菌总量、放线菌总量随设施蔬菜种植年限延长而逐渐递减，种植年限3 a显著高于CK，种植年限5、7 a低于CK。种植年限3 a的微生物PLFAs总量、细菌、放线菌总量分别是5 a的1.40倍、1.51倍、1.57倍，且3 a分别与5 a之间差异显著。真菌总量随设施种植年限延长而增加，且3 a低于CK，种植年限5、7 a显著高于CK。种植年限3 a中cy19:0含量最高，为2.37 nmol/g，且显著高于其他处理。种植年限7 a中18:1ω9c含量最高，为1.23 nmol/g，且显著高于其他处理。不同种植年限设施菜地土壤革兰氏阴性细菌/革兰氏阳性细菌比值均小于1，表明设施土壤细菌以革兰氏阳性细菌为主，且随种植年限延长逐渐降低。革兰氏阳性细菌总量、革兰氏阴性细菌总量大小顺序均为3 a>CK>5 a>7 a，其中，种植年限7 a与其他处理之间差异显著。土壤细菌/真菌各种植年限表现为3 a>CK>5 a>7 a，与CK相比，种植5、7 a分别显著降低了24.36%、44.43%。

表3 不同处理PLFAs类群和含量Tab.3 Types and concentrations of microbial PLFAs with different treatments nmol/g

续表3 不同处理PLFAs类群和含量Tab.3(Continued) Types and concentrations of microbial PLFAs with different treatments nmol/g

2.3 土壤微生物群落结构及其与土壤化学性质的关系

基于PLFAs层次聚类分析结果可知，不同种植年限设施菜地土壤微生物群落结构差异明显，各处理3个重复都聚类在一起(图1A)，其中3 a与5、7 a距离较远，5、7 a距离较近。主成分分析进一步证实了不同种植年限设施菜地土壤微生物群落结构差异明显(图1B)，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)共解释了土壤微生物群落结构总变异的91.17%，其中PC1解释了总变异的84.67%，PC2解释了总变异的6.50%。种植年限3 a投射点分布在第三象限，种植年限5 a投射点分布在第四象限，种植年限7 a投射点分布在第一、四象限，这表明3 a分别与5、7 a的土壤微生物群落结构具有明显差异；5、7 a相聚较近，说明微生物群落结构相似度较大。CK投射点分布在第二象限，与3、5、7 a均不在同一象限，表明露天与设施菜地的土壤微生物群落结构明显不同。

为分析土壤化学性质对土壤微生物群落结构的影响，对土壤微生物群落结构与土壤化学性质进行冗余分析(图2)。第1轴(RDA1)和第1轴(RDA2)共同解释了93.96 %的变异，其中，RDA1的贡献值为89.27 %。土壤全氮含量、速效钾含量、微生物量碳含量、C/N与微生物群落结构有极显著关系。土壤pH值、有机碳、微生物量氮对土壤微生物群落结构有显著影响。

2.4 土壤微生物群落功能多样性

由图3可知，各处理AWCD值在培养24 h内无显著变化，24 h后AWCD值均有明显增加。培养24～96 h，种植年限3 a、CK的AWCD值增速较快，土壤微生物活性明显增强。种植年限5、7 a的AWCD值在120～168 h增速较快。168 h后，各处理的AWCD值增加速率逐渐趋于平缓。不同处理AWCD值大小顺序为3 a>CK>5 a>7 a，种植年限3 a的土壤微生物代谢活性较强。可见，随设施蔬菜种植年限延长，土壤微生物代谢活性逐渐减弱。

通过对土壤微生物功能多样性指数分析可知(表4)，不同处理Shannon指数、Simpson指数、McIntosh指数变化趋势一致，大小顺序均为3 a>CK>5 a>7 a。种植年限3 a的Shannon指数、Simpson指数、McIntosh指数均高于其他处理，分别与5、7 a之间差异显著。种植年限5、7 a的Shannon指数、Simpson指数、McIntosh指数均显著低于CK。可见，种植年限3 a后土壤微生物群落功能多样性指数逐渐下降。进一步对土壤微生物群落功能多样性指数与土壤化学性质进行相关性分析(图4)，土壤pH值与Shannon指数有极显著正相关关系，与Simpson指数、McIntosh指数有显著正相关关系。土壤有机碳含量与Shannon指数有显著正相关关系。铵态氮、硝态氮含量与Shannon指数、Simpson指数有显著负相关关系。土壤微生物量碳、氮含量与C/N分别与Shannon指数、Simpson指数、McIntosh指数有极显著正相关关系。

表4 不同处理土壤微生物群落功能多样性指数Tab.4 Functional diversity indexes of the soil microbial community under different treatments

由表5可知，不同处理土壤微生物对6类碳源利用存在差异，其中，氨基酸类、碳水化合物类利用较高，酚类、胺类利用较低。种植年限3 a的土壤微生物对酚类、羧酸类、氨基酸类、碳水化合物类、胺类的利用能力均显著高于其他处理。种植年限5 a的土壤微生物对氨基酸类利用最低，对酚类、羧酸类、聚合物类、碳水化合物类、胺类的利用高于7 a，低于3 a、CK。

进一步对6类碳源和土壤化学性质进行相关性分析(图4)，土壤pH值、有机碳含量、速效钾含量与聚合物类有极显著正相关关系，与胺类有显著正相关关系。土壤全氮含量与酚类、羧酸类、氨基酸类、碳水化合物类有显著负相关关系，与聚合物类、胺类有极显著负相关关系。土壤铵态氮、硝态氮含量与聚合物类有极显著负相关关系。C/N、微生物量碳、微生物量氮含量分别与酚类、聚合物类、胺类有极显著正相关关系。

3 结论与讨论

3.1 不同设施蔬菜种植年限对土壤特征的影响

土壤酸化是影响设施蔬菜高效持续经营的重要障碍因子，是众多学者关注的焦点[26-27]。史桂芳等[28]研究表明，当设施菜地土壤pH值小于5.5时，不利于蔬菜生长发育。本研究结果表明，随设施蔬菜种植年限延长，土壤pH值逐渐降低。当设施蔬菜种植5 a，pH值小于5.5，土壤酸化明显将影响蔬菜的产质量。然而，曹舰艇等[29]研究表明，随设施蔬菜种植年限延长，土壤pH值呈V形变化趋势。同时，刘兆辉等[30]研究也表明，设施蔬菜种植10 a后土壤才出现酸化现象，与本研究结果不一致，可能与研究区域立地条件、施肥种类、施肥量等因素有关。

宋蒙亚等[31]研究表明，种植年限3 a时土壤有机碳、速效氮含量富集，3～6 a土壤全氮、速效磷含量逐渐降低。然而，朱余清等[32]研究表明，随设施蔬菜种植年限延长，土壤有机质、速效钾、速效磷含量逐渐增加。本研究结果也表明，设施菜地土壤全氮、铵态氮、硝态氮含量均高于CK，随种植年限延长逐渐增加，可能由于设施大棚处于相对封闭的高温、高肥、少雨环境，养分淋溶较少，导致土壤养分富集。土壤有机碳含量随设施蔬菜种植年限延长逐渐降低，可能与该区域较少施用有机肥有关，不能弥补设施蔬菜多茬种植中有机碳的消耗。设施菜地土壤速效钾含量均小于CK，随种植年限延长逐渐递减，可能由于该区域设施菜地土壤钾补充过少，同时设施蔬菜也吸收带走大量的钾，导致土壤速效钾含量逐渐减少。唐冬等[33]研究表明，设施菜地土壤盐渍化的主要特点是硝态氮积累，硝态氮含量随种植年限延长而增加，与本研究结果一致。设施菜地土壤由于不合理的施用氮肥，且硝态氮不能通过雨水进行淋洗，同时设施蔬菜大棚内高温引起硝态氮向地表富集，最终导致土壤次生盐渍化越来越严重。可见，设施菜地土壤酸化与盐渍化具有同步性。QIU等[34]研究表明，土壤C/N与环境恶化有显著相关关系。可见，随设施蔬菜种植年限延长，土壤C/N逐渐降低，导致土壤环境逐渐恶化，可能与大量施用氮肥且较少施用有机肥等因素有关。

张国红等[35]研究表明，随设施蔬菜种植年限延长，土壤微生物数量逐渐增加。然而，杜连凤等[36]研究表明，随设施蔬菜种植年限延长，土壤微生物数量呈现先增加后减少趋势。本研究中，随设施蔬菜种植年限延长，土壤微生物量碳呈V形变化趋势，微生物量氮逐渐降低。可见，在设施蔬菜种植过程中，短期施肥可调节土壤养分含量，有利于促进土壤微生物生长。然而，当长期大量施肥时，导致土壤pH值显著下降，土壤酸化严重，对土壤微生物生长有抑制作用。

3.2 不同设施蔬菜种植年限对土壤微生物群落结构和功能多样性的影响

土壤微生物PLFAs总量为14.81～22.26 nmol/g，高于江苏省常熟市的设施菜地土壤[31]，造成土壤微生物PLFAs总量差异可能与取样深度、种植年限等因素有关。本试验土壤取样深度为0～10 cm，该土层养分含量相对较高，能够为土壤微生物提供较好的生存环境。周德平等[37]研究表明，土壤pH值是影响土壤微生物群落结构变化的重要因素。因此，随设施蔬菜种植年限延长，土壤pH值下降可能是导致土壤微生物PLFAs总量、细菌、放线菌总量减少的主要因素。然而，土壤真菌总量随设施蔬菜种植年限延长而增加，真菌数量增多将导致土传病害加重[35]。土壤细菌偏好质量较好的环境，土壤有机碳可为细菌生长提供能量来源，但较低pH值会抑制其生长[38]。可见，随设施蔬菜种植年限延长，土壤酸化严重及有机碳含量下降，将不利于土壤细菌生长。JANVIER等[39]研究表明，细菌/真菌可以用来指示土壤生态系统稳定性，细菌/真菌值降低，不利于植物生长。本研究中，种植年限3 a的细菌/真菌值高于CK，土壤微生态较稳定，有利于蔬菜生长；随设施蔬菜种植年限延长，土壤真菌数量逐渐增加，细菌数量逐渐减少，导致土壤细菌/真菌值降低，土壤质量逐步恶化。可见，设施蔬菜种植年限3 a后，土壤微生物群落结构发生显著变化，土壤微生态严重失衡，加剧了土传病害发生，不利于设施蔬菜持续高效生产。

STADDON等[40]研究表明，土壤酸化及氮素积累都将降低微生物多样性。本试验结果表明，种植年限3 a、CK的土壤微生物功能多样性指数及AWCD值高于其他处理，可能与土壤酸化不明显有关。设施蔬菜种植年限3 a后，土壤酸性增强，铵态氮、硝态氮含量明显增加，导致土壤微生物代谢活性降低，微生物群落功能多样性指数下降。土壤微生物偏好利用的碳源类型为碳水化合物，可能与设施蔬菜连年种植产生的根系分泌物对微生物群落具有选择性有关[41-47]。可见，设施菜地土壤环境对微生物群落结构及功能多样性的影响具有复杂性。下一步需借助高通量测序技术对设施菜地土壤中参与养分循环及蔬菜病害有关的微生物类群进行研究，以便更好地解释设施蔬菜长期种植引起土壤质量变化的微生物机制，为设施蔬菜可持续经营管理措施的制定提供科学依据。

综上所述，随设施蔬菜种植年限的延长，土壤pH值降低，全氮、硝态氮含量积累，导致土壤酸化、盐渍化严重，并最终引起土壤微生物的群落结构和代谢活性发生显著变化。因此，贵州武陵山片区设施蔬菜种植3 a后，应采取轮作，休闲，合理配施有机肥、无机肥等措施，改善土壤质量，维持土壤微生态平衡，通过对土壤微生物群落进行定向调控来实现设施菜地土壤的高效可持续利用。