高效液相色谱-原子荧光光谱联用法测定地龙蛋白粉保健品中砷形态

王 颖 ，王 剑

（1.银川能源学院化学与生物工程学院，宁夏银川7 5 001 0；2.宁夏食品质量监督检验二站，宁夏银川7 5 0001）

地龙蛋白粉取自地龙，越来越多应用在心脑血管、内分泌、呼吸系统等疾病的预防中，具有减少三高等很多的保健功能。结果表明，部分地龙蛋白粉中含有机砷量较少，但个别无机砷含量相对较高。

砷是一种在土壤中的有毒类金属元素，砷的不同形态毒性也相差较大。以无机砷毒性最大，有机砷的毒性较弱[1]。目前所知的食药材中以二甲基砷（DMA）、一甲基砷（MMA）、砷胆碱(AsC)和砷甜菜碱(AsB)等形式存在[2]。在主要的砷化物中，它们的毒性大小顺序为As3+>As5+>MMA>DMA，而砷甜菜碱(AsB)和砷胆碱(AsC)被认为是没有毒性的[3]。国际癌症研究机构(IARC)已确认无机砷及其化合物为人类I类致癌物[4]，地龙蛋白粉作为保健品，若砷含量超标，则对消费者的健康构成潜在风险[5]。

本文总结前人经验，用高效液相色谱-原子荧光光谱联用技术建立了蛋白粉中砷形态的分析方法，本方法相对准确，为蛋白粉类的安全性评价提供了更加可靠的科学方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

AFC-9750-LC-200液相色谱-原子荧光光谱联用仪（北京海光仪器有限公司）、TG16-WS离心机（转速≥8000r/min，长沙湘仪离心机仪器有限公司）、MX-F固定式混匀仪（大龙兴创实验仪器（北京）有限公司）、KQ5200B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、微孔滤膜（有机相）：0.45μm、C18小柱。

硝酸（GR，国药集团化学试剂有限公司）；盐酸、正己烷、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硼氢化钾、氢氧化钠（AR，国药集团化学试剂有限公司）；砷酸根标准溶液（17.5±0.4μg/g，标准物质，中国计量科学研究院）；亚砷酸根标准溶液（75.7±1.2μg/g，标准物质，中国计量科学研究院）；一甲基砷标准溶液（25.1±0.8μg/g，标准物质，中国计量科学研究院）；二甲基砷标准溶液（52.9±1.8μg/g，标准物质，中国计量科学研究院）；地龙蛋白粉（三个批次，来源于宁夏市场）。

1.2 标准系列溶液配制

1.2.1 标准中间液

砷酸根标准溶液取用体积133.0μL定容体积10mL；亚砷酸根标准溶液取用体积574.0μL定容体积10mL；一甲基砷标准溶液取用体积399.0μL定容体积10mL；二甲基砷标准溶液取用体积190.0μL定容体积10mL。

1.2.2 混合标准使用液

分别吸取As3+中间液、As5+中间液、MMA中间液与 DMA中间液各 0.25 mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、2.50mL于25 mL容量瓶配制出10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、100ng/mL的混合标准使用液，用流动相定容，摇匀。

1.3 样品的前处理

1.3.1 提取

准确称取1.0g（精确至0.001 g）试样于50mL离心管中，加入20mL硝酸（0.05 mol/L）溶液，静置过夜。于90℃恒温箱中浸提2.5 h，每半小时取出混匀一次。取出，冷却至室温，离心15 min，转速为8000r/min，取5 mL上清液置于离心管中，加入5 mL正己烷，振摇，静置，弃去上层正己烷，正己烷洗涤2次，收集提取液，经0.45μm有机滤膜过滤，准备净化。

1.3.2 净化

C18小柱使用前需进行活化，依次用10mL甲醇、15 mL水通过，水完全流出后，上样，弃去前2mL，收集流出的溶液，测定。

1.4 仪器参数设定

AFC-9750-LC-200液相色谱-原子荧光光谱联用仪参数：阴离子交换柱（Hamilton PRP-X100，250×4.1mm，10μm）；保护柱（Hamilton PRP-X100，25mm×2.3mm，12～20μm）；流动相（2mg/mL磷酸氢二钠，6mg/mL磷酸二氢钾）；进样体积：100μL；流速：1 mL/min；氢化物发生还原剂：35 g/L KBH4；载流：10%HCl；AFS条件空心阴极灯：高性能砷空心阴极灯，波长193.7 nm；元素灯As；灯电流：80mA；光电倍增管负高压：320V；原子化器高度：8 mm；载气：氩气，流速：300mL/min；屏蔽气：氩气，流速：900mL/min；蠕动泵，转速：60r/min。

2 仪器条件的优化

分别对载流、还原剂和流动相的浓度、光电倍增管负高压等几个因素进行确定。设定条件为：还原剂浓度3.5%、流动相比例50∶50、光电倍增管负高压320V。

2.1 载流浓度

选取5%、7%、10%与15%浓度的盐酸溶液。

图1 载流的选择

由图1可知，增大载流浓度，峰面积逐渐增加。当载流浓度为10%的时候，四种形态砷的分析结果达到最佳，故载流选择10%的盐酸溶液为实验条件。

2.2 还原剂浓度

选取2.0%、3.0%、3.5%与4.0%浓度的硼氢化钾溶液。

图2 还原剂的选择

由图2可知，随着还原剂增大三价砷的峰面积增大，二甲基砷峰面积影响时下时上，而一甲基砷和五价砷的浓度降低，改变还原剂浓度对峰面积影响没有规律。通过对比谱图基线发现还原剂浓度越低基线强度越高，并且基线嘈杂，对低浓度样品检测有较大的影响，而还原剂为4.0%时结果与3.5%时的结果差别很小。故本实验选取还原剂浓度为3.5%。

2.3 流动相

选取磷酸氢二钠溶液（2mg/mL）与磷酸二氢钾（6mg/mL）溶液混合，体积比分别为30∶70、40∶60、50∶50和 60∶40。

由图3可知，流动相体积比为30∶70和40∶60时，出峰时间过长且检测效果不好，在60∶40时，三价砷和二甲基砷的分离情况不好，两个峰之间分离不开有拖尾且有杂峰，体积比为50∶50时，四个目标峰的分离效果较好、分析时间较短，并且基线强度相比其他比例流动相是最低的。故选择流动相比例为50∶50。

2.4 负高压

选取280V、300V、320V和340V的光电倍增管负高压。

由图4可知，负高压为280V和300V时，四种砷的检测信号较低；负高压为340V时，基线强度提高近一倍，影响了分析结果；负高压320V时，对四种砷的检测信号相对影响不大，故选择320V的负高压。

图3 流动相选择谱图

图4 负高压的选择

3 方法学考察

3.1 重现性试验

两人对同一试样各做三组试验，结果如表1所示。

由表1可知，两人的RSD值均在0.00%～5.00%之间。

3.2 稳定性试验

称取1.0g地龙蛋白粉试样一份，提取完毕后放置 1 h、2h、4h、6h、8 h 和 24h 进行检测。计算 RSD值，评价其稳定性（见表2）。

由表2可知，在第10天一甲基砷RSD为6.16%。在第4天三价砷、五价砷、一甲基砷有下降趋势，第6天五价砷的含量回升，有部分三价砷通过微生物的作用，转化为五价砷。所以砷形态的稳定性为3天，超过三天有机砷和无机砷将会互相转化。

3.3 样品加标回收率

取已知样品含量的样品6份，添加一定浓度的标准溶液，混均提取，测定，计算加标回收率，四种形态砷的回收率均在93.0%～101.0%之间，如表3所示。

由表3可知，四种形态砷的回收率均在93.0%～101.0%之间，RSD值在1.84%～3.69%之间。

3.4 精密度试验

精密度是指同一组数据彼此接近程度。对含有三价砷、二甲基砷、一甲基砷、五价砷的混合标准溶液重复进样6次，算出RSD值（见表4）。

由表4可知，RSD为4.23%～5.04%之间。

3.5 最低检出限和定量限

以三倍信噪比求得最低检出限，十倍信噪比求得定量限，形态砷最低检出限和定量限如表5所示。

4 样品测定

分别对宁夏市场三个批次的地龙蛋白粉样品进行形态砷的含量检测，测定结果见表6，国标限度要求不得大于0.7 mg/kg。结果发现1#样品三价砷、一甲基砷含量均高，砷总量超标；2#、3#样品砷总量合格，三种样品均未检出二甲基砷。

表1 重现性试验

表2 稳定性试验

表3 加标回收试验结果

表4 精密度试验

表5 形态砷最低检出限和定量限

5 结论

本文以高效液相色谱-原子荧光光谱联用法测定地龙蛋白粉中不同形态的砷含量，通过对载流、还原剂和流动相的浓度、光电倍增管负高压等仪器进行条件性实验，最终确立一定范围内最优参数，建立了对地龙蛋白粉中四种砷形态分析的方法。结果表明，四种形态砷在10～100ng/mL范围内线性关系良好[6]，平均加标回收率较好、最低检出限较低。分别对宁夏市场三个批次的地龙蛋白粉样品进行形态砷的含量检测，四种形态砷可同时测定，为相关部门对地龙蛋白粉的质量监控提供参考。

表6 地龙蛋白粉中砷形态的检测结果