蛋白酶对皮革降解性能的研究

2021-03-09赵宝宝周裕仙丁海燕乔一凡王全杰

皮革与化工 2021年1期

赵宝宝，周裕仙，丁海燕，乔一凡，王全杰

（烟台大学化学化工学院，山东烟台264005）

皮革是很好的胶原蛋白来源，对废弃皮革的有效利用，不但减少了我国每年产生的大量的各种革屑废弃物，减小环境污染，而且回收利用得到的产品也可以销售，为皮革行业再添一笔财富。对废弃皮革的利用主要是通过对皮革进行不同程度的降解得到胶原蛋白，皮革的降解一般按照降解程度分为初级降解和最终降解。初级降解是指皮革内部结构和组成发生不可逆转的变化，皮革的特性功能丧失很大一部分，而最终降解是指皮革内部结构和组成完全被破坏，蛋白质等大分子被分解成CO2、H2O等小分子化合物，皮革的特性功能完全丧失。

皮革降解的过程事实上就是蛋白质水解的过程。蛋白质水解可得到变性蛋白、水溶蛋白、多肽及氨基酸[1-3]。蛋白质的水解可以通过酸处理、碱处理、蛋白酶处理。其中蛋白酶处理有其它方法无可比拟的优越性：反应速度快，时间短，无环境污染，提取的水解胶原蛋白纯度高，水溶性好，理化性质稳定，而且随着生物技术水平的提高，酶制剂的来源广泛，活性也不断提高，价效比也大幅度降低，为其在工业化生产中的应用提供了极大空间[4]。

蛋白酶催化蛋白质水解模式，可分为内切和外切两种模式。外切是指蛋白酶能够从肽链的任一端切下单个氨基酸；内切是指能够与蛋白质肽链内部的肽键反应，将大的肽链不断剪断成更小的肽链。蛋白酶水解胶原蛋白的作用机理十分复杂，影响因素较多，蛋白酶种类对胶原的水解程度有很大的影响[5]，不同的蛋白酶对不同的底物有不同的作用，反过来底物的结构和组成也会影响酶的活力，不同的酶可将胶原分解为分子量不同的多肽或氨基酸。碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶均为肽链内切酶，三种酶对肽链两端的组成和结构是有一定要求的，并不是对所有肽键有作用，只有肽键两边或一边有特定氨基酸时，蛋白酶才会对肽链起作用。不同的酶可能还会有抑制作用，影响酶的活力，降低蛋白酶的作用效果，造成不必要的损失。

本课题主要通过蛋白酶降解皮革的实验，重点考察和探究胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶三种酶对膦鞣革、无铬鞣革、铬鞣革三种皮革的降解效果，通过对实验数据的分析，优化酶的降解条件。

1 实验部分

1.1 试剂及仪器

膦鞣坯革（工业品，浙江明新旭腾皮业有限公司）；无铬鞣坯革（工业品，浙江明新旭腾皮业有限公司）；铬鞣坯革（工业品，浙江明新旭腾皮业有限公司）；胰蛋白酶（分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司）；木瓜蛋白酶（分析纯，北京索莱宝科技有限公司）；碱性蛋白酶（分析纯，北京索莱宝科技有限公司）；四硼酸钠（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；L-酪氨酸（分析纯，上海蓝季科技发展有限公司）；三氯乙酸（分析纯，天津市光复精细化工研究所）；干酪素（分析纯，北京双旋微生物培养基制品厂）；柠檬酸（分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司）；结晶乙酸钠（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；盐酸（分析纯，烟台三和化学试剂有限公司）；氢氧化钠（分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司）；磷酸氢二钠（分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司）；磷酸二氢钠（分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司）；福林试剂（分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司）；碳酸钠（分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司）；硫酸铜（分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司）；酒石酸钾钠（分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司）。

752紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；水浴恒温振荡器（江苏省金坛市医疗仪器厂）；电热恒温鼓风干燥箱（上海右一仪器有限公司）；Phs-3D功能型pH计（上海三信仪表厂）；恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂）。

1.2 蛋白酶的种类优化

1.2.1 酶活力的测定

1.2.1.1 绘制酪氨酸-吸光度标准曲线

（1）标准液的配制

取 5 个试管分别标号为 1、2、3、4、5，向其中分别加入 1、2、3、4、5 mL 100μg/mL 酪氨酸溶液，再分别向其中加入 9、8、7、6、5 mL 蒸馏水，最后可得酪氨酸实际浓度分别为 10、20、30、40、50μg/mL。

（2）对标准溶液反应显色

取2个试管分别标记为A和B，A为空白对照，B为标准试样。用1 mL移液管移取1.0mL蒸馏水，标记为A；用1 mL移液管移取1.0mL标准液，标记为B。加5.0mL的0.4moL/L碳酸钠溶液，再向其中加入1 mL福林试剂，在40℃恒温水浴25 min，最后在680nm测吸光度。

1.2.1.2 测定蛋白酶活力

（1）反应显色

取2个试管分别标记为A和B，A为空白对照，B为酶样。在试管A中，加蒸馏水1.0mL，在40℃，预热5 min，加0.4moL/L三氯乙酸2.0mL，摇匀；40℃，保温 10min；加 10.00mg/mL 酪素 1.0mL，摇匀；静置15 min，过滤；取1.0mL滤液，加0.4moL/L碳酸钠5.0mL，再向其中加入1 mL福林试剂，在40℃恒温水浴25 min，最后在680nm测吸光度。在试管B中，加酶样 1.0mL，在 40℃，预热 5 min，加10mg/mL 酪素 1.0mL，摇匀；40℃，保温 10min，加0.4moL/L三氯乙酸2.0mL，摇匀，取出静置15 min，过滤，取1.0mL滤液，加0.4moL/L碳酸钠5.0mL，加福林试剂使用液1.00mL，在40℃恒温水浴25 min，最后在680nm测吸光度。

（2）计算酶的活性

式中：A——样品吸光度

K——吸光度常数

4——反应试剂的总体积（mL)

10——酶解反应时间（min）

N——酶样稀释总倍数

其中，吸光度常数等于A=1时酪氨酸的量的数值。

1.2.2 不同种类蛋白酶对皮革的降解率

1.2.2.1 实验方案

称取适量已烘干的铬鞣革、膦鞣革、无铬鞣革分别加入盛有酶液的250mL碘量瓶中，并记录皮革质量。设置水浴振荡器温度为40℃，将已加入皮革的蛋白酶溶液放入水浴振荡器中，震荡反应4h。将反应后的皮革烘干称其质量，留取反应后的溶液测其蛋白质含量。

1.2.2.2 皮革降解率的计算

式中：M0——皮革降解前的质量（g）

M1——皮革降解后的质量（g）

1.2.2.3 蛋白质浓度的测定

（1）配制标准蛋白质溶液

取 7个试管分别标号为 1、2、3、4、5、6、7，向其中分别加入0、1、2、4、6、8、10mL 2.0mg/mL标准蛋白质溶液，再向其中分别加入1、9、8、6、4、2、0mL蒸馏水，最后可得浓度为 0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL的标准蛋白质溶液。

（2）测定蛋白质浓度

取2个试管分别标记为1、2，1为空白管，2为样品管。向其中分别加入0、1 mL样品，再向其中加入1、0mL蒸馏水，分别加入5 mL试剂A摇匀，室温放置10min，再分别加入0.5 mL试剂B迅速摇匀，30℃恒温水浴30min，640nm测吸光度。

将等体积的4%碳酸钠溶液和0.2moL/L氢氧化钠溶液混合，1%硫酸铜溶液和2%酒石酸钾钠溶液等体积混合，然后将混合后的两种溶液按50∶1（体积比）混合摇匀，即为试剂A。试剂B为福林试剂。

1.3 蛋白酶水解条件的优化

1.3.1 浓度优化

在温度、pH等相同条件下，配置5 g/L、10g/L、15 g/L、20g/L、30g/L、40g/L 的蛋白酶溶液，反应 4h，对不同方法鞣制的坯革进行降解实验，以三种坯革的降解率和降解液中蛋白质的含量变化趋势为指标，确定蛋白酶的最佳浓度。

1.3.2 反应时间优化

在温度、pH等相同条件下，配置最优浓度的酶液，反应不同时间，对三种不同方法鞣制的坯革进行降解实验，以三种坯革的降解率为指标确定最佳反应时间。

2 结果与讨论

2.1 蛋白酶活力测定结果

2.1.1 吸光度常数的确定

图1 酪氨酸标准曲线图Fig.1 Standard graph of tyrosine

其中吸光度常数K=113.4。

2.1.2 蛋白酶活力的测定

表1 三种蛋白酶的活力Tab.1 The activity of three proteases

表1是三种蛋白酶的活力结果，由表可知，碱性蛋白酶的活力最高，胰蛋白酶其次，木瓜蛋白酶的活力最小。

2.2 蛋白酶种类优化结果

2.2.1 皮革降解率的比较

表2 同浓度蛋白酶溶液对不同皮革的降解率Tab.2Degradation rates of protease solution with the same concentration to different leather

图2不同种类蛋白酶对不同鞣制方法成革降解率的影响Fig.2Effects of different proteases on degradation rates of leather by different tanning methods

图2 是不同种类蛋白酶对不同鞣制方法成革降解率的影响，由图可知，碱性蛋白酶对三种皮革的降解效果最好，木瓜蛋白酶其次、胰蛋白酶最差，故碱性蛋白酶为最适蛋白酶。其中，从降解效果来看，降解效果最好的是膦鞣革，其次是无铬鞣革，最差的是铬鞣革。从三种酶的降解效果来看，铬鞣革最难降解，这主要是由于铬鞣革中的铬离子与蛋白酶能够发生一定程度的结合，从而使蛋白酶的活力下降甚至失活，削弱了蛋白酶的降解效果。另外，铬鞣革中，铬与胶原蛋白质的结合最牢固，蛋白酶对胶原大分子的水解难度加大。从实验结果来看，蛋白酶的活力大小，并不完全决定对皮革的降解效果。从表2可以看出，尽管胰蛋白酶的活力比木瓜蛋白酶的活力要高，但胰蛋白酶对三种皮革的降解效果并没有木瓜蛋白酶的好。这一方面与蛋白酶的作用专一性有关，另外一方面，由于蛋白酶的分子量并不相同，相对而言，小分子量的蛋白酶更容易进入底物内部，与底物充分接触，使其降解，因此，在对皮革的降解处理中，蛋白酶降解底物的不同，降解效果不同。

2.2.2 最佳蛋白质浓度的确定

（1）蛋白质标准曲线

表3 蛋白质标准液测定结果Tab.3 Determination results of protein standard solution

图3 蛋白质标准曲线Fig.3 Protein standard curve

（2）蛋白质浓度

表4 同浓度酶液降解液中蛋白质浓度Tab.4Protein concentrations in the degradation solution with the same concentration of enzyme

图4 不同酶对降解液中蛋白质浓度的影响Fig.4Effects of different enzymes on protein concentration in the degradation solution

图4 是不同酶对降解液中蛋白质浓度的影响，由图可知，对三种皮革而言，同浓度下碱性蛋白酶降解液中蛋白质浓度最高、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶降解液中蛋白质浓度较小。

对三种皮革而言，同种酶对降解液中蛋白质的浓度的影响也不同，膦鞣革中的蛋白质浓度最高，无铬鞣革和铬鞣革依次减小。这主要是由于三种皮革不同的鞣制方法决定的，铬鞣剂与胶原结合最好，所以铬鞣革难以降解；无铬鞣革是采用植物和醛类结合鞣制而成，其中的丹宁成分能够阻止降解；膦鞣是有机物，所以最容易降解，因此溶液里面蛋白含量高。

2.3 碱性蛋白酶浓度优化结果

2.3.1 皮革降解率变化趋势

图5 碱性蛋白酶浓度对皮革降解率的影响Fig.5 Influence of alkaline protease concentration on leather degradation rate

图5 是碱性蛋白酶浓度对皮革降解率的影响，由图可知，随着碱性蛋白酶浓度的增加，三种皮革的降解率均呈现出先升高后降低的趋势，碱性蛋白酶在15 g/L时，三种皮革的降解率较高，铬鞣革可达到4.57%，无铬鞣革26.38%，膦鞣革36.59%。三种皮革的降解率仍然是膦鞣革最大，无铬鞣革其次，铬鞣革最小，且铬鞣革的降解率变化很小。可以看出，酶浓度的提高并没有提高皮革的降解率，反而有所下降，这可以从酶促反应动力学的角度解释，碱性蛋白酶浓度较低时，皮革的降解速率与碱性蛋白酶的浓度成正比，随着碱性蛋白酶浓度的增加，三种皮革的降解速率亦增大；但是当碱性蛋白酶浓度过高时，则会产生反作用，碱性蛋白酶之间会相互抑制，致使酶的活力下降，皮革的降解速率降低。另外，对于铬鞣革而言，降解过程中不断会有铬离子脱落出来，而铬离子也可能会抑制酶的活力，造成铬鞣革的降解速率严重下降，而这一影响因素也是导致铬鞣革的降解率远比膦鞣革、无铬鞣革的降解率低的主要原因。

2.3.2 蛋白质浓度变化趋势

图6 碱性蛋白酶浓度对降解液中蛋白质浓度的影响Fig.6 Effect of alkaline protease concentration on protein concentration in degradation solution

表5 不同浓度碱性蛋白酶对不同皮革的降解率Tab.5 Degradation rates of different concentrations of alkaline proteases to different leather

表6 不同浓度碱性蛋白酶降解液中蛋白浓度Tab.6 Protein concentrations in alkaline protease degradation solution at different concentrations

图6是酶浓度对水解液中蛋白质浓度的影响，由图可知，随着碱性蛋白酶浓度的提高，水解蛋白质浓度也不断提高，不过在酶浓度20g/L出现拐点，其后尽管酶浓度不断提高，但水解蛋白质浓度增速缓慢。三种皮革的水解蛋白质浓度仍然是膦鞣革最高，无铬鞣革其次，铬鞣革最小。可以看出，一定程度上，随着酶浓度的提高，胶原蛋白的降解程度不断加大。