果树脱毒技术研究进展

2021-03-08陈冲曹贵寿王国平刘伟樊新平霍辰思史华平

山西果树 2021年1期

陈冲曹贵寿王国平刘伟樊新平霍辰思史华平

摘要：果树病毒病是无药可治的系统性病害，严重威胁果树的生长发育和果业生产。综述了果树病毒的种类，并将脱毒方法总结为五大类进行阐释：物理脱毒法，化学脱毒法，生物组织脱毒法，变温、抗病毒剂、超低温与茎尖组培结合脱毒法和抗病毒基因工程脱毒法。并对果树脱毒的发展趋势进行了分析。

关键词：果树;脱毒技术;进展

文章编号：2096-8108（2021）01-0072-04 中图分类号：S66 文献标识码：A

Abstract：Fruit tree virus disease is a systemic disease that can not be treated by medicine， which seriously threatens the growth and development of fruit trees and the production of fruit industry. the types of virus in fruit trees were summarized， and the virus-free methods were summarized into five categories： physical virus-free method， chemical virus-free method， biological tissue virus-free method， variable temperature， anti-virus agent， combination of ultra-low temperature and shoot tip tissue culture， and virus-free genetic engineering method. Finally， the development trend of virus-free fruit trees was analyzed.

Keywords：fruit tree;virus free technique;progress

1 概述

病毒病是果树的重要病害种类之一，是影响果树产量和品质的重要原因。目前已发现的高等植物病毒病害已超过700种，每种果树病毒危害都有几种甚至十几种[1]（见表1）。果树是多年生营养繁殖为主的植物，寄生病毒侵染后全身发病且终生带毒，而且，随着营养繁殖系数增大而传播速率加快。病毒破坏树体的生理机能，导致树势、产量和品质下降，严重时全株衰退枯死，尤其是一些潜隐性病毒危害更大。

目前，果树病毒病无药可治。在实际防治中，除了严格检疫、消除传毒源、防治传播虫媒外，最有效的措施是使用脱毒繁殖材料。应该注意的是：这里所说的脱毒，是指不具有经济重要性的、按要求应脱除的病毒，而非不带任何病毒[2]。

2 果树脱毒技术

2.1 物理脱毒法

2.1.1 热处理法

热处理法也叫温热疗法，可分为恒温处理和变温处理，其原理是利用病毒和寄主植物对高温（35～38 ℃的热水或热气）忍耐性的差异，病毒部分或全部钝化失活，失去侵染的能力而逐渐消亡，从而得到一小部分不含病毒的植物分生组织，然后进行组织复壮培育。值得注意的是：在高温处理过程中，温度选择应当处在植物最高耐受温度和杀死病毒温度的之间的区域，并且这个区域越大，越有利于脱毒。

张尊平等[3]（2013）用热处理脱毒技术研究了8个葡萄品种5种葡萄病毒（葡萄斑点病毒、葡萄扇叶病毒、沙地葡萄茎痘相关病毒、葡萄卷叶相关病毒-1、葡萄卷叶相关病毒-2）的试管苗，研究结果表明：62个茎尖中29个茎尖脱除了上述5种病毒。康晓育等[4]（2016）等研究发现：相同热处理条件下，不同的苹果基因型脱毒率存在差异。王林脱毒效率最高，脱除率100%;金矮生ACLSV（苹果褪绿叶斑病毒）和ASPV（苹果茎痘病毒）两种病毒的同时脱除率为100%;ASGV（苹果茎沟病毒）的脱除率也在80%以上;首红、株美海棠、天汪1号、L-6的脱除率较低。

热处理脱毒法要求的设备条件简单，操作也比较容易，是被世界多个国家应用最广的技术。但是，热处理法仅对球状和类似纹状的病毒导致的病害才有效，对杆状和线状病毒就不能用这种方法脱除，因而具有一定的局限性，须与别的方法配合使用。

2.1.2 超低温脱毒

近几年，超低温脱毒是研究的热点，它是建立在超低温保存基础上的一门新型高效脱毒技术。原理主要是利用茎尖分生组织细胞与分化细胞结构上的差异，选择只允许有限数量外植体存活的条件，从而消除一大批感染病毒的组织，茎尖超低温的脱毒率很高[5]。

盛宏亚、王红清等[6]（2016）以草莓为材料，通过优化玻璃化超低温脱毒技术的程序，建立了草莓莖尖（1～2 mm）玻璃化超低温脱毒体系，利用RT-PCR技术检测草莓斑驳病毒的脱毒率为100%。李百荃等[7]（2016）采用苹果茎尖超低温疗法研究表明：1.5 mm和0.5 mm两种大小茎尖均不能脱除 ASGV，ASPV 的脱毒率均为80%～85%;0.5 mm的茎尖不能再生，1.5 mm茎尖再生率明显高于1.0 mm的茎尖。

2.2 化学脱毒法

抗病毒药剂的主要作用是抑制病毒增殖和移动，在三磷酸状态下阻止病毒RNA帽子结构形成，或使病毒暂时处于无活性状态。常用的抗病毒化学药物有三氮唑核苷（病毒唑）、双乙酰二氢-5-氮尿嘧啶（DA-DHT）、5-二氢尿嘧啶（DHT）、8-氮鸟嘌呤、放线菌素D等。这些抗病毒剂常常通过直接注射或喷施到带病毒的植株上，或者加到植株生长的培养基上[8]。

晏娜等[9]（2009）用 RT-PCR 技术探讨 3 种化学药剂处理对苹果继代苗脱毒效率。结果表明：阿昔洛韦和病毒灵作用下苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎痘病毒的脱除率均达到 100%，而苹果茎沟病毒的脱除率分别为 63%和 62%。病毒醚的作用下3种病毒的脱除率均达到 100%。

2.3 生物组织脱毒法

2.3.1 茎尖培养脱毒法

茎尖培养是指对植物顶端的原分生组织和它衍生的分生组织的培养。茎尖培养的材料可以是10～100 μm的茎尖分生组织，也可以是几十毫米的茎尖或更大的芽。茎尖培养繁育无病毒苗是生产中应用最广泛的一种方法。

高庆玉等[10]（1993）研究认为：1～3 mm的茎尖起不到培育脱毒苗的效果，只有小于0.5 mm的茎尖才能获得无病毒母株;但从成活率和接种时间上看，大于0.3 mm草莓茎尖比0.3 mm好。因此，一般以切取0.3～0.5 mm生长点（带1～2个叶原基）为宜。董淑英等[11]（2001）利用茎尖培养对苹果进行脱毒技术研究也证实了上述的结论。

2.3.2 微体嫁接脱毒法

木本植物茎尖培养生根困难、生长缓慢。Murashige等在茎尖培养的基础上，提出了微体嫁接技术，即将茎尖分生组织嫁接在试管中经脱毒培养的实生苗砧木切断面上而得到完整植株。Murashige等用这种方法脱除了柑橘的两种病毒[12]。

祁鹏志等[13]（2007）采集带有典型衰退病症状的新余蜜柑茎尖进行了茎尖微芽嫁接，黄龙病和衰退病脱毒率100%。目前微嫁接成功的植物有杏、酿酒葡萄、桃、苹果和柑橘。

2.3.3 珠心组织脱毒法

此法在柑橘类上应用广泛[14]。植物受精产生的种子绝大多数只形成一个胚，而柑橘的种子常形成多胚。多胚中只有一个胚是受精后产生的有性胚，而其余是珠心细胞形成的无性胚，一般称珠心胚。通过珠心胚培养可以得到无病毒的珠心胚苗。由于珠心与维管束系统无直接联系，因此，用此技术对柑橘的主要病毒与类病毒病原体，包括不能被热处理除去的病毒均十分有效。

2.3.4 花药或花粉培养脱毒

这种方法一般适于自交亲合或自交不亲合植物优良无病毒育种原始材料。由花粉培育出愈伤组织再分化出的完整植株，含有的病毒很少或几乎不含病毒。大泽胜次（1974）等利用草莓花药培养法获得了脱毒苗[15]。高庆玉[10]等（1993）用草莓花药组培，其脱毒率高于用幼叶和茎尖产生的脱毒苗。所以，花药培养的植株脱毒率高，可靠性强。

花药培养脱毒法中，选择合适大小的花蕾非常关键，尽量选取处于密封状态的小花蕾，此时的花粉发育期为单核靠边期[16]。利用花药培养脱毒苗，不仅可以省去病毒鉴定工作，还可快速繁殖出大量脱毒植株。

2.4 变温、抗病毒剂、超低温与茎尖组培结合脱毒法

茎尖脱毒培养法具有脱毒率高，脱毒速度快的优势，但这种方法技术要求较高、植物的存活率低。目前，通常将茎尖培养与其他脱毒方法配合使用，如与热处理、抗病毒剂、超低温与茎尖培养相结合脱毒。

董雅凤等[17]（1998）对苹果茎沟病毒的研究中发现：梨茎尖培养成活率仅为28%，且脱毒效果差。热处理后进行茎尖培养，脱毒率和成活率分别增加11.7%和54.3%。因为病毒粒子通常在34～60 ℃下处理一段时间，则会发生钝化，这样茎尖外植体大小可在较大的范围内，提高了培养的成功率。冯超红等[18]（2014）用苹果茎尖（≥0.5 mm）结合超低温处理和热处理分别脱除了苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒。顾沛雯[19]（2008）在脱毒处理中，将热处理与茎尖培养相结合，使成活率和脱毒率较单纯茎尖培养提高7.5%和8.5%，其中变温比恒温处理成活率提高15.6%，而脱毒率相差不大;病毒剂处理与微茎尖相结合培养结果表明，病毒剂对葡萄病毒具有良好的抑制作用，但对茎尖的生长发育有影响。胡国君等[20]（2012）以苹果茎沟病毒和苹果褪绿叶斑病毒离体砂梨植株为研究材料，比较分析了热处理、化学处理（病毒醚）及二者相结合对脱除病毒的效果，结果显示化学处理与热处理相结合可明显提高病毒脱除效果。

2.5 抗病毒基因工程

随着分子生物学和基因工程的飞速发展，特别是1986年首次将烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白基因成功导入烟草，防治病毒病产生了新的途径，目前已有多种病毒基因被导入到植物的基因组中而产生不同程度的抗病毒效果，这些病毒基因分属于编码序列和非编码列两大类型。前者有病毒运动蛋白、病毒外壳蛋白、核酶、复制酶等，后者有卫星RNA、缺陷RNA和超敏RNA，目前果树上采用的抗病毒策略主要有外壳蛋白基因、运动蛋白基因和病毒卫星RNA [1]。

田莉莉等[21]（2013）为创制抗病毒植物新材料，采用 Gateway 技术构建了含 3种苹果潜隐性病毒 CP 基因片段的 RNAi 植物表达载体，用冻融法将其转入根癌农杆菌菌株EHA105，并用叶盘法遗传转化烟草，经 PCR 鉴定，结果表明目的基因片段已成功转入烟草中。

3 展望

果樹脱毒技术（表2）不仅可有效地防治病毒病的危害，而且可以脱除其他细菌和真菌病害，可显著地提高果品产量和质量。无病毒果树可大幅度提高产量，优质果率增加30%～50%。无病毒苗木抗逆性强，适合25℃以下的山坡瘠薄土地栽培[22]，而且减少化肥农药用量，符合生态农业要求。因此，实行无病毒栽培已成为当今世界果树生产发展的方向。

我国这方面起步较晚，脱毒技术体系、病毒检测和脱毒栽培尚处于试验、示范阶段。我国果树无病毒栽培面积面积比例低，为了适应当今经济发展和产业结构调整的需要，建立适合我国国情的无病毒果树生产体系，并在全国范围内边试验、边示范、边推广，使我国果树传统的栽培技术有一个新的变革，推动果树生产向优质增效方向发展。

研究过程中，不仅要注重脱毒各个操作环节的影响因素，更要注重脱毒机理性的研究，形成系统化的理论体系。同时，须加强科研单位与企业合作，使技术应用商业化，在实际应用中发现更多的问题并解决科研资金不足的问题，这是发展脱毒技术最快捷有效的途径。再者，加强国际交流，可以适当引进适合我国实际情况的技术，并在此基础上进行深入的研究。

参考文献

[1]王国平，洪霓.果树病毒检测与脱除技术的研究进展[J].华中农业大学学报，2004（6）：685-691.

[2]杨俊玲，侯义龙，李雄.果树脱毒及病毒检测技术的研究进展[J].中国水土保持，2004（3）：21-23+32+47.

[4]康晓育，李帼英，赵新红.4个苹果品种和2种砧木试管苗对热处理脱毒效应的研究[J].山西果树，2016（4）：1-4.

[3]张尊平，范旭东，胡国君，等.葡萄试管苗热处理脱毒技术研究[J].中国果树，2013（1）：39-41.

[5]刘文斌.梨病毒超低温脱除技术的改进及带病毒与脱毒梨离体植株生长特性比较[D].华中农业大学，2014.

[6]盛宏亚，万继花，徐川，等.利用玻璃化超低温技术脱除草莓斑驳病毒（SMoV）的初步研究[J].中国农业大学报，2016（3）：53-57.

[7]李百荃.苹果属（Malus）试管苗植株再生、茎尖超低温保存和脱毒技术研究[D].西北农林科技大学，2016.

[8]邱静，汤浩茹，曹会娟，等.园艺植物茎尖冷冻疗法脱毒的技术研究[J].植物生理学报，2014（1）：1-6.

[9]晏娜.化学处理和热处理脱除苹果潜隐性病毒的研究[D].河北农业大学，2009.

[10]高庆玉，李光裕，周恩.关于草莓脱毒技术研究[J].东北农学院学报，1993（3）：231-236.

[11]董淑英，孙静，潘忠强，等.苹果茎尖脱毒技术研究[J].河北农业科学，2001（2）：30-35.