五子衍宗丸多糖对过氧化氢所致心肌细胞损伤的影响*

陈桂林，徐姗，吴紫娟，吴祎

(江苏省常州市第二人民医院药学部，常州 213000)

冠状动脉球囊扩张、冠状动脉内溶栓以及冠状动脉旁路移植术在缺血性心脏病治疗中应用广泛，其能够恢复心肌血流，挽救患者生命，但手术造成的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤已成为日益突出的问题[1-2]。研究表明，心肌损伤区过量自由基是引发心肌损伤的关键，自由基清除剂能缓解组织和细胞损伤[3-5]。五子衍宗丸最早记载于唐代，由五味药材(枸杞子、菟丝子、覆盆子、五味子、车前子)组成，有研究认为五子衍宗丸多糖具有清除自由基作用[6]。笔者在本研究中从五子衍宗丸提取多糖(即五子衍宗丸多糖)，并用于治疗心肌缺血性疾病模型，以探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1试药与仪器 五味子(批号：20180108)、菟丝子(批号：20180115)、枸杞子(批号：20180118)、覆盆子(批号：20180122)、车前子(批号：20180130)各50 g，均购自广州致信药业有限公司，经本院药学部吴祎副主任中药师鉴定，均符合2015年版《中华人民共和国药典》标准。

白细胞介素6(IL-6)标准品购自美国Sigma公司(批号：2018025556)，IL-12标准品购自美国Sigma公司(批号：2018025891)；正常小鼠心肌细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司(批号：CP-M073)；噻唑蓝(MTT)比色法试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司(批号：2018-1123)；乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号分别为20180315，20180419，20180423，20180321，20180410，20180417)，IL-6酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(批号：2018-5297)和IL-12 ELISA试剂盒(批号：2018-09028)购自上海碧云天生物技术有限公司；小鼠抗人B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)单克隆抗体(批号：2018036500)、兔抗鼠Bac多克隆抗体(批号：2018029985)、兔抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-3)单克隆抗体(批号：2018061135)、二抗辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG、HRP标记的山羊抗小鼠IgG(批号：2018090046)购自美国Sigma公司。ELISA酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司(仪器型号：HBS-1096C)；免疫蛋白印迹法(Western blotting)电泳仪购自美国Bio-rad公司。

1.2五子衍宗丸多糖的提取与鉴定 将五味子、菟丝子、枸杞子、覆盆子以及车前子等5 种中药材粉碎，根据《中华人民共和国药典》2015年版记录混匀，石油醚回流2 次。药渣以50%乙醇回流提取，所得样品以水溶解，再以正丁醇萃取，将药渣水提取浓缩液混合均匀，乙醇沉淀，干燥后得五子衍宗丸多糖[6]。

五子衍宗丸多糖的鉴定：准确吸取样品测定液2.0 mL，置25 mL比色管，加入50 g·L-1苯酚溶液1.0 mL，旋转混匀器混匀，小心加入浓硫酸10.0 mL于旋转混匀器上，小心混匀，置沸水浴中煮沸2 min，冷却至室温，分光光度计在波长485 nm处以试剂空白为参比，1 cm比色皿测定吸光度值。从标准曲线上查出葡聚糖含量，计算样品中多糖含量[6]。

1.3细胞的分组与处理 取正常小鼠心肌细胞，培养，随机分为5组：阴性对照组，正常小鼠心肌细胞分离纯化后培养[7-8]；诱导组，正常小鼠心肌细胞培养液加入100 μmol·L-1过氧化氢(H2O2)，反应2 h；大剂量组，以1×10-4mol·L-1五子衍宗丸多糖培养正常小鼠心肌细胞24 h，加100 μmol·L-1H2O2反应2 h；中剂量组，以5×10-5mol·L-1五子衍宗丸多糖培养正常小鼠心肌细胞24 h，加入100 μmol·L-1H2O2反应2 h；小剂量组，以1×10-5mol·L-1五子衍宗丸多糖培养正常小鼠心肌细胞24 h，加入100 μmol·L-1H2O2反应2 h。

1.4心肌细胞活力检测 采用MTT比色法检测分离纯化的小鼠心肌细胞活力。将小鼠心肌细胞分组处理，每孔加5 mg·mL-1MTT 20 μL，反应4 h。除去上清液，加二甲基亚砜(DMSO)150 μL，酶标仪检测波长570 nm处吸光度值(A值)。

1.5总抗氧化能力及氧化平衡体系酶测定 应用酶偶联法检测心肌肌酸激酶(creatine kinase，CK)；比色法检测心肌细胞总抗氧化能力(total antioxidant capacity of cardiomyocytes，T-AOC)，2，4 -二硝基苯肼显色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性，硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量，黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力，二硫代二硝基苯甲酸法检测谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)含量，钼酸铵法检测过氧化氢酶(catalase，CAT)活力。

1.6ELISA法检测小鼠IL-6与IL-12水平 酶标仪测量在波长450 nm处A值，以标准品A值为横坐标，以0，0.5，1，2，5，10 ng·μL-1IL-6的A值为纵坐标；以IL-12标准品A值为横坐标，以0，5，10，20，50，100 pg·μL-1IL-12A值为纵坐标，根据Curve Expert1.3版软件绘制标准曲线。根据样品A值，以Excel WPS计算相应浓度。

1.7Western blotting检测相关蛋白表达 将小鼠心肌组织研磨成粉末，裂解30 min，4 ℃离心，提取上清液，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白活性测定试剂盒检测蛋白定量。取蛋白30 μg进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)，电泳分离的蛋白转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，室温下5%脱脂牛奶反应1 h，充分洗涤，分别添加一抗小鼠抗人Bcl-2单克隆抗体(1：1 000 )、兔抗鼠Bax多克隆抗体(1：1 000 )及兔抗人caspase-3单克隆抗体(1：1 000)，4 ℃过夜，充分洗涤，添加HRP标记的山羊抗兔IgG(1：10 000)或HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1：10 000)，室温反应30 min，充分洗涤，电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)化学发光液反应1 min，全自动数码凝胶图像分析系统摄影。

2 结果

2.1心肌细胞活力 结果见表1。与阴性对照组比较，诱导组心肌细胞A值降低(P<0.05)，提示其细胞活力下降；与诱导组比较，五子衍宗丸多糖各剂量组A值升高(P<0.05)，提示五子衍宗丸多糖可有效提升被H2O2损伤的心肌细胞活力。

2.2心肌细胞上清液LDH与CK释放量 结果见表2。与阴性对照组比较，诱导组心肌细胞上清液LDH和CK释放量升高(P<0.05)；与诱导组比较，五子衍宗丸多糖各剂量组细胞上清液LDH与CK释放量均降低(P<0.05)。

2.3心肌细胞SOD与MDA含量测定结果 结果见表3。与阴性对照组比较，诱导组心肌细胞SOD活力降低(P<0.05)；与诱导组比较，五子衍宗丸多糖各剂量组SOD活力增加(P<0.05)；与阴性对照组比较，诱导组细胞MDA含量升高(P<0.05)；与诱导组比较，五子衍宗丸多糖高剂量组MDA降低(P<0.05)。

2.4心肌细胞GSH-Px与CAT含量 结果见表4。与阴性对照组比较，诱导组GSH-Px活性降低；与诱导组比较，五子衍宗丸多糖中、大剂量组细胞GSH-Px活性更高(P<0.05)；与阴性对照组比较，诱导组CAT活性降低(P<0.05)；与诱导组比较，五子衍宗丸多糖各剂量组CAT活性升高，其中大剂量组CAT活性明显高于诱导组(P<0.05)。

表1 5组心肌细胞活力测定结果

表2 5组心肌细胞上清液LDH与CK释放量测定结果

2.5心肌细胞中IL-6与IL-12 结果见表5。与阴性对照组比较，诱导组细胞培养液IL-6与IL-12含量升高(P<0.05)；与诱导组比较，五子衍宗丸多糖各剂量组细胞培养液IL-6与IL-12含量降低(P<0.05)。

2.6Bcl-2，Bax及caspase-3蛋白表达 结果见表6及图2。Western bloting结果表明，诱导组细胞培养液Bcl-2 及caspase-3蛋白表达高于阴性对照组，Bax蛋白表达量低于阴性对照组(均P<0.05)。与诱导组比较，五子衍宗丸多糖各剂量组Bcl-2和caspase-3蛋白表达量减少，Bcl-2 及caspase-3蛋白表达下调，Bax蛋白表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 5组心肌细胞SOD及 MDA含量测定结果

表4 5组心肌细胞GSH-Px与CAT含量测定结果

3 讨论

心肌细胞损伤时，心肌细胞中CK、LDH以及AST等酶被释放入血，因此其均属于心肌损伤关键标志物[9-10]。MDA导致机体出现脂质过氧化物[11-12]，一般可用于检测细胞损伤程度[13-14]。MTT检测发现，H2O2可抑制小鼠心肌细胞活性，五子衍宗丸多糖能提升过氧化损伤心肌细胞活力。本研究结果显示，正常心肌细胞会被H2O2损伤，心肌细胞外LDH和CK释放量升高，细胞内MDA含量升高，表明H2O2引发细胞过氧化损害。

表5 5组心肌细胞上清液IL-6与IL-12测定结果

表6 5组心肌细胞Bcl-2，Bax及Caspase-3蛋白表达量测定结果

与诱导组比较，五子衍宗丸多糖各剂量组细胞外液LDH和CK量降低，细胞内MDA含量降低，表明五子衍宗丸多糖可缓解细胞损伤。SOD可以清除自由基，在抗氧化机制中十分关键[15-16]。GSH-Px可维护细胞膜功能[17-18]。本研究显示，五子衍宗丸多糖能提升过氧化损伤心肌细胞SOD、GSH-Px及CAT活性。表明五子衍宗丸多糖可有效提升心肌细胞SOD、GSH-Px及CAT活性，抑制脂质过氧化反应，对受损细胞进行修复。即五子衍宗丸具有清除氧自由基、抗氧化损伤、维持机体抗氧化防御系统平衡和抑制多元醇通路异常活跃作用，从而减轻组织细胞损伤，其机制可能与其抗氧化应激、抑制炎症细胞因子TNF-α表达有关。本研究与殷金龙等[22]研究相互印证，即五子衍宗丸抗炎活性可能通过抑制核因子-κB 信号通路介导的炎症反应以及抗氧化应激实现。

图2 5组Bcl-2，Bax及caspase-3蛋白表达

综上所述，五子衍宗丸多糖可有效缓解心肌细胞过氧化损伤，抑制机体脂质过氧化反应，缓解炎症因子对心肌细胞的损伤，其作用机制可能与下调Bcl-2 及Caspase蛋白表达、上调Bax蛋白表达有关。因此推测五子衍宗丸多糖可用于治疗心血管疾病。