分化型甲状腺癌术后循环肿瘤细胞检测与刺激性甲状腺球蛋白相关性的研究

张富强， 智建潮， 李德宇， 丁献敏， 杨光， 杨辉*

（1 郑州大学附属肿瘤医院／河南省肿瘤医院 核医学科， 河南 郑州450003；2 河南省虞城县人民医院 肿瘤科， 河南 商丘476300）

近年来甲状腺癌的发病率逐年上升， 根据2014 年美国监测、 流行病学及预后项目数据， 甲状腺癌发病率为12.90／10万， 甲状腺癌的预后较好、 生存率高， 对于病灶局限于甲状腺内的患者， 5 年生存率达99.90%， 但有远处转移的患者则明显降低， 仅为54.70%［1－3］。 循环肿瘤细胞 （CTCs） 检测能尽早发现微转移， 有助于准确判断甲状腺癌预后、 指导个体化治疗、预测复发及转移。 本研究回顾性分析131 例甲状腺癌患者的资料， 探讨分化型甲状腺癌术后循环肿瘤细胞检测 （CTCs） 与刺激性甲状腺球蛋白 （sTg） 二者之间的相关性， 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性分析2019 年1 月至2019 年12 月我院收治的131 例甲状腺癌患者的临床资料， 男49 例， 女82 例， 年龄9 ～81 岁， 平均 （45.95 ± 14.83） 岁。 所有患者均经手术病理确诊为分化型甲状腺癌， 其中乳头状癌121 例、 滤泡癌10 例。

1.2 研究方法①刺激性甲状腺球蛋白 （sTg） 检测： 所有患者住院前均停服优甲乐2 ～4 周， 血清TSH＞30 mIU／L。 住院后空腹状态下抽取患者肘静脉血5 mL， 离心15 min 分离血清， 采用电化学发光免疫分析法检测血清sTg 水平。 按sTg 结果分为sTg＜2 ng／mL 组 （A 组）， 2 ng／mL≤sTg＜10 ng／mL 组 （B 组）、10 ng／mL≤sTg ＜50 ng／mL 组 （C 组）、 sTg≥50 ng／mL 组 （D组）。 ②分离富集CTCs： 由我院分子病理实验室完成， 具体步骤［4］： 将每个受试者的5 mL 血液样本收集到EDTA 抗凝管中，然后使用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞， 并用直径为8 μm 的孔校准膜过滤。 过滤后， 将剩余的细胞重悬于含有4%甲醛的磷酸盐缓冲盐水中5 min， 转移至滤管中， 并再次过滤。 抽气阀设置为产生至少0.08 MPa 的真空压力。 ③原位杂交分析： 该测定法在24 孔板中进行， 其上富集的细胞用蛋白酶处理， 然后与上皮生物标记物EpCAM 和CK8／18／19、 间质生物标志物Vimentin 和Twist、 白细胞生物标志物CD45 特异的捕获探针杂交。 记录循环肿瘤细胞个数， 结果≥5 个判读为阳性结果。 ④病例随访： 对患者进行随访观察， 每3 ～6 个月行连续动态观察， 必要时行颈部淋巴结、 肺部结节穿刺活检， 取得病理结果从而明确患者诊断。

1.3 观察指标①CTCs 检测阳性率。 ②不同sTg 浓度组的CTCs检测阳性率。 ③CTCs 检测结果和sTg 浓度之间的相关性。 ④绘制ROC 曲线， 确定临界值并评估诊断效能。

1.4 统计学处理应用SPSS 24.0 统计软件处理。 计量资料均行正态性分析及方差齐性检验， 符合正态分布的计量数据以±s 表示， 符合非正态分布的计量数据以中位数、 极大值和极小值表示。 双偏态变量数据相关性分析采用Spearman 法分析；各种率比较采用四格表χ2检验。 以穿刺病理确诊结果为标准将CTCs 检测结果绘制ROC 曲线； P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTCs 检测阳性率以及CTCs 检测与sTg 浓度相关性131例患者共检出2 400 个循环肿瘤细胞， 中位数10 个， 最小0 个，最大131 个。 按≥5 个为阳性结果， 阳性率73.3% （96／131）（典型病例见图1）。 sTg 浓度中位数6.97 ng／mL （0.02 ～895.62）。Spearman 相关性分析结果显示， CTCs 检测结果和sTg 浓度双变量之间呈显著性正相关 （r ＝0.418， P ＜0.01）。

图1 甲状腺癌CTCs 检测结果阳性典型图像

2.2 各组间CTCs 检测阳性率比较D 组的CTCs 阳性率显著高于其他三组， B、 C 组显著高于A 组 （P ＜0.05）， B、 C 组间无显著性差异 （P ＞0.05）。 见表1。

表1 各组间的CTCs 检测阳性率比较

2.3 ROC 曲线分析与临界值确定及诊断效能评估以穿刺活检及多种影像学确诊结果为金标准， 将CTCs 检测结果绘制ROC曲线 （图2）， 以约登指数最大点对应的临界值决定CTCs 检测的临界值为4.5 个CTCs 计数／5 mL。 CTCs 检测的敏感度91.1%，特异性为78.0%， AUC 为0.907 （95%CI： 0.845 ～0.969）。

图2 ROC 曲线分析CTCs 检测结果的诊断效能

3 讨论

近年来研究［5］表明， 甲状腺癌患者TgAb 阴性状态下低水平sTg 预示较低的复发率及较好的预后， 但是sTg 受到残留甲状腺等因素的影响， 其水平高低及动态变化与疾病的缓解、持续及复发密切相关。 国内一项大样本回顾性研究［6］结果显示sTg 特异度仅为67.3%。 丁献敏等［7］检测首次131I 治疗前sTg 浓度以预测甲状腺复发转移， 结果显示6 例假阴性， 患者有远处转移灶， 但是sTg 水平很低。 以上研究结果表明单纯依靠sTg 和131I 全身显像来预测分化型甲状腺癌微转移是远远不足的。 自从19 世纪Ashworth 首次在静脉血中检测到肿瘤细胞并提出微转移的理论， 经过多位学者的研究［8－9］， CTCs 技术逐渐成为临床热点； 传统的CellSearch 方法对DTC 敏感性较低，本研究使用分离富集和原位杂交 （iFISH） 技术， 大大提高了分化型甲状腺癌循环肿瘤细胞的检测效率及准确性。 尽管本研究表明sTg 偏高的甲状癌患者外周血检测到循环肿瘤细胞， 但是样本量少， 未能系统化研究； 本研究对影像学难以发现的隐匿性转移灶 （＜2 mm） 寻求一种有效的生物学指标用来检测和评估甲状腺癌早期转移和复发， 可实现对甲状腺癌的精准化治疗。

综上所述， CTCs 检测结果与sTg 浓度呈显著正相关， 外周血CTCs 检测能准确预测分化型甲状腺癌的早期转移， 可为分化型甲状腺癌分期、 预后及治疗提供重要依据。