分子检测技术对结核性脑膜炎的诊断应用

李 樱 综述 单煜恒 审校

结核性脑膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染脑膜引起的非化脓性炎症，具有病死率高，发病年龄低等特点。即使经过规范化治疗，依然有超过1/3的患者死亡，存活的患者也常遗留有多种神经系统后遗症[1]。早期诊断和及时、规范的治疗是改善TBM预后的重要手段。然而，由于临床表现缺乏特异性、检验手段缺乏敏感性，部分患者在疾病早期难以得到准确诊断[2]。

诊断TBM的关键在于对脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)中Mtb的检测，常规检测方法包括涂片染色镜检法及Mtb培养法[3]。但这两种常规方法耗时长且敏感度低，难以实现TBM的早期诊断[4]。随着分子生物学技术的不断发展，利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术扩增Mtb特异性碱基序列(探针法)、利用基因测序技术检测微生物种类(测序法)等分子检测技术逐渐应用于Mtb的实验室检测。以其标准化的操作流程，及时高效的诊断效能，这些分子检测技术逐渐成为目前TBM实验室诊断的研究热点。本文将围绕不同分子检测技术在TBM诊断中的应用现状和前景进行综述。

1 Amplicor与COBAS TaqMan MTB技术

由瑞士Roche公司研发的Amplicor是首批应用于Mtb实验室检测的商业化试剂盒。该技术利用特异性引物选择性扩增16S rRNA基因中一个长为584 bp 的DNA片段，再将扩增子与生物素标记的特异性探针杂交，进而利用酶联免疫技术进行比色鉴定，当660 nm的吸光度值(OD660)>0.35时，判读为Mtb阳性[5]。在2003年的一项研究中，作者发现以Mtb培养为金标准时，Amplicor诊断TBM的敏感度仅为55.6%，近半数患者呈现为假阴性。而当调整判读阈值后(OD660>0.2)Amplicor的特异度又大幅下降。鉴于Amplicor技术在诊断效能中的缺陷，Roche公司在其基础上开发了COBAS TaqMan MTB技术。该技术是首个基于TaqMan探针的诊断检测方法。2011年，Kim应用Amplicor及COBAS TaqMan MTB技术对406个CSF样本进行检测，发现以Mtb培养阳性为金标准时，Amplicor诊断TBM的敏感度与特异度分别为58.3%与99.5%，而COBAS TaqMan MTB的敏感度与特异度分别为79.1%与98.2%[6]。这一结果提示，COBAS TaqMan MTB技术在TBM 诊断中具有较为理想的诊断效能及应用前景。

2 Mtb核酸直接扩增(amplified Mtb direct test，AMTD)技术

与Amplicor类似，由美国Gene-probe公司研发的AMTD技术也是一种早期应用于Mtb检测的分子诊断技术。该技术使用转录酶扩增的方法扩增Mtb的16S rRNA，并利用吖啶脂标记的探针与扩增产物结合，从而进行化学发光检测。由于rRNA在Mtb细胞中具有较高的拷贝数，因此AMTD技术也具有较高的敏感度。Chedore通过对311个CSF样本进行检测，发现以Mtb培养为金标准时，AMTD诊断TBM的敏感度与特异度分别为94%及99%。在另一项研究中，Lang等[7]发现AMTD在抗酸染色阴性的TBM患者中也具有良好的诊断效能，敏感度可达83%。该技术可在2.5 h内实现样本中Mtb的快速检测，且整个反应过程在单一温度及反应管内进行，易于操作且不易污染。但是，由于rRNA只存在于活的Mtb细胞中，因此抗结核治疗可能会影响AMTD的检测结果。

3 环介导的等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术

LAMP技术是由日本Eiken Chemical公司研发的一种快速、简便且有效的DNA扩增技术。该技术属于恒温扩增检测技术的一种，仅需要2h即可完成对Mtb的鉴定[8]。LAMP可应用多种引物分子探针实现多个靶基因的扩增。其中，最常用的靶基因位点为IS6110，其次为MPB64。2011年，Nagdev[9]通过对27例TBM患者的CSF样本进行检测，发现以Mtb培养为金标准时，LAMP(IS6110)诊断TBM的敏感度为88%，特异度为80%。在另一项研究中，Modi等[10]通过对250例TBM患者及100例非TBM患者的CSF进行检测，发现LAMP(IS6110)及LAMP(MPB64)诊断TBM的敏感度分别为87%及88%。上述结果提示LAMP对于TBM具有良好的诊断效能。但是，LAMP 技术也存在明显不足。首先，应用于LAMP的引物分子探针设计较为复杂，且不同的引物分子探针的诊断效能不一。其次，LAMP的扩增产物常带有核酸内切酶残端，无法直接进行定量分析，只能对扩增片段的有无进行定性分析。

4 分子线性探针技术(molecular line probe assay，LPA)

LPA主要应用于多耐药性Mtb的检测。该技术使用能够靶向扩增Mtb耐药基因的特异性引物，将扩增子与生物素标记的分子探针杂交，利用化学显色技术进行结果判读。目前，应用LPA检测Mtb的方法主要有两种：靶向利福平(rifampin，RIF)耐药基因rpoB的INNO-LiPA Rif TB Assay和靶向异烟肼耐药基因katG、inhA的GenoType MTBDRplus[11]。2015年，Solomons等[12]检测了GenoType MTBDRplus的诊断效能，发现以TBM临床诊断为金标准时，该检测技术的敏感度为33%，特异度为98%。虽然LPA对TBM诊断的敏感度并不理想，但是该技术对于Mtb耐药性的检测非常准确，敏感度与特异度均超过95%。

5 GeneXpert MTB/RIF技术

GeneXpert MTB/RIF(简称Xpert)技术是一种以全自动半巢式实时定量荧光PCR为基础，rpoB基因为靶点，利用GeneXpert平台自动提取DNA并扩增的一种分子检测技术[13]。该技术应用5种相互重叠的引物分子探针，选择性扩增与RIF耐药相关的rpoB基因核心区域，从而实现对Mtb DNA及RIF耐药性的同时检测。它具有方便、快速等特点，约2 h即可读取结果。结果判读依靠探针的循环阈值，即Ct值。当不少于2个探针的Ct值≤38时，即可判读为Mtb阳性，当探针的早期与晚期Ct值之差>3.5时，即提示Mtb对RIF耐药[14]。自2009年由美国 Cepheid 公司研发以来，Xpert技术逐步应用于临床，并于2010年及2013年先后经过世界卫生组织及美国药品食品监督局批准，成为诊断TMB的一线方法[15]。

2014年，Denkinger等[16]在研究中发现，以Mtb培养阳性为金标准时，Xpert诊断TBM的敏感度超过80%，而以临床诊断为金标准时，其敏感度也可达到60%。2018年，Kohli等[17]对33项关于Xpert诊断TMB的研究进行荟萃分析，发现Xpert诊断TMB的合并敏感度为71%、合并特异度为98%。自Xpert检测系统得到国家食品药品监督管理总局批准后，我国部分医院也开展这一检测技术，并发现以Mtb培养阳性为金标准时，其诊断TBM的敏感度约为80%，而以临床诊断为金标准时，其敏感度约为50%[18-20]。上述结果提示，Xpert对于TBM的诊断具有良好的诊断效能。但是，价格高、通量小的特点限制其在基层医院的广泛应用。而且，早期应用该技术是否能够改善TBM患者的总体预后还有待进一步研究。

6 Xpert MTB/RIF Ultra技术

Xpert MTB/RIF Ultra(简称Xpert Ultra)技术是在Xpert技术基础上的发展与改进，两者在检测原理及操作流程等方面基本相同。而Xpert Ultra技术应用了更丰富的引物分子探针，不仅包括原有的4种靶向rpoB基因的引物分子探针，还包括2种靶向多拷贝序列IS6110和ISl081的引物分子探针。这一改动使Xpert Ultra具有较低的检测阈值，从而提高了Mtb检测的阳性率。2018年，Bahr[21]开展了一项包括129例TBM患者的诊断实验，发现以Mtb培养、Xpert或Xpert Ultra阳性为金标准时，Xpert Ultra的敏感度为95%，高于Mtb培养及Xpert的敏感度，具有统计学差异。而在近期发表的一项前瞻性诊断实验中，Donovan等[22]发现以Mtb培养阳性为金标准时，Xpert Ultra及Xpert诊断TBM的敏感度分别为59.5%及55.3%，而以临床诊断为金标准时，两者的敏感度分别为47.2%及37.6%，均未发现统计学差异。因此，Xpert Ultra技术在诊断TBM中是否优于Xpert技术尚需要进一步研究及荟萃分析。

7 宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)技术

mNGS技术是目前应用最为广泛的基因测序技术，具有成本低、通量高、速度快等特点，能够检测样本中微生物的全部遗传信息。这种检测技术不需要制备特异性的分子引物，无差别的对样本中所含的全部病原体进行筛查，通过与基因库信息比对，确定潜在的致病菌。理论上，mNGS在TBM的诊断中具有一定的应用前景。2019年，邢小微[23]在关于mNGS诊断中枢神经系统感染性疾病的研究中发现，当以Mtb培养或Xpert为金标准时，mNGS诊断TBM的敏感度为60%、特异度为96%。在同年的另一项相关的研究中，Wang等[24]得到了类似的结果，在该研究中mNGS诊断TBM的敏感度为66%。但是，mNGS在TBM诊断的应用中还存在诸多问题。首先，mNGS的检测结果并不唯一，常可在检测中发现其他致病微生物的存在，使得结果难以判读；其次，标本提取、实验室检测等操作过程中可能带来外源性核酸污染，使mNGS结果的可信性大为下降；再次，关于mNGS诊断TBM的研究不足，证据欠缺，也尚无相关指南及共识推荐。

近年来，随着核酸扩增技术的发展与进步，应用于诊断TBM的分子检测技术层出不穷。这些检测技术具有快速、可重复及高通量等优点，但是也存在很多问题亟待解决。首先，CSF的低含菌量问题不仅影响传统检测方法的Mtb检出率，也影响分子检测技术的Mtb检出率。增加CSF样本含量并在检测前离心处理可能对于提高分子检测技术的敏感性有一定作用，但尚需相关研究证实。其次，诊断TBM的金标准尚有争议，而且相关研究对金标准的选择并不一致。不同的金标准选择会得到分子检测技术不同的诊断效能。比如，应用Mtb培养为金标准时，可能会高估分子检测技术的敏感度并低估其特异度；而应用临床诊断为金标准时，则可能会低估分子检测技术的敏感度并高估其特异度。第三，分子检测技术较传统的Mtb检测方法更为昂贵，而且在基层医院难以开展。

虽然存在以上不足，但是分子检测技术的出现与发展已将Mtb的检测从细胞水平提升至分子水平。在今后的研究中，如何降低检测费用并提高分子检测技术的诊断效能将成为相关领域的热点问题。另外，建立一套全面的临床应用综合评价系统也将有助于分子检测技术在TBM临床诊断中的进一步应用与开展。