原发性肝癌中P38γ高表达及其对肿瘤形成作用

陈 翔 胡 晟 周玉庆 高 宏 吴 林 赵 伟 张 璠

原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是最常见且恶性程度最高的肿瘤之一，在世界范围内，每年有超过84.1万的新发肝癌病例[1-2]。p38γ，又称为SAPK3、ERK6，属于MAPK家族成员[3-4]。其最初是从脂多糖刺激的单核细胞中分离得到，包括p38α、p38β、p38γ和p38δ四个亚型[5-6]。p38γ组织分布具有高度特异性,在骨骼肌中大量表达；并且其在肿瘤细胞的发生、凋亡、转移中，p38MARK发挥着重要作用。p38γ高度表达于几种人类恶性肿瘤细胞系，并且可以调节肿瘤干细胞分化、迁移、肿瘤形成等生物过程。研究显示，p38γ在人乳腺癌[7-8]、结肠癌[9]、直肠癌[10]及星形胶质细胞瘤组织[11]中高表达；特别是在三阴性乳腺癌组织中表达显著增加，且其高表达和乳腺癌的不良预后呈正相关[12-13]。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2017年3月至2019年4月于我医院收诊的肝癌患者。纳入标准：经免疫组化、病理切片及影像学确诊为原发性肝癌；且患者既往未接受过手术、化疗及靶向药物治疗。排除标准：合并其他癌症患者及精神疾病患者。所有患者均同意并签署知情同意书。依据纳入及排除标准，本研究患者共270例，年龄24～74岁，平均年龄为53.1岁。收集患者的一般临床资料：年龄、性别、肿瘤大小及病理分期。

1.2 蛋白免疫印记(Western-Blot)检测P38γ蛋白表达

样本组织用RIPA(含蛋白酶抑制剂)提取蛋白质，再经BCA法测定其蛋白浓度，确保Western-Blot所用蛋白量保持一样。蛋白提取定量后进行变性并SDS-PAGE电泳：12%分离胶+5%浓缩胶；电泳条件为80 V，30 min；150 v，1 h。电泳结束后进行Western-Blot转膜：转膜条件为100 mA，1 h。转膜结束后，1%脱脂牛奶封闭1 h；1‰TBST洗膜3次，加入一抗(抗P38γ或β-actin)孵育过夜；1‰TBST洗膜3次，加入二抗(1∶10 000)孵育2 h；1‰TBST洗膜3次，加入发光液显影。蛋白表达量采用Image J软件计算，并计算不同样本蛋白表达的相对量。

1.3 P38γ干扰( Si-P38γ)质粒转染

Si-P38γ质粒由汉恒生物构建，经转化、摇菌、提质粒后测序确定P38γ序列正确无误。培养肝癌细胞Hep3B至密度为70%时，用lipo 3000转染，培养观察Si-P38γ对P38γ表达的影响：分别在12 h，24 h，36 h，48 h取蛋白样品进行Western-Blot分析。Hep3B细胞培养条件为：MEM培养基，10%胎牛血清，1%非必须氨基酸，37 ℃，5%CO2。

1.4 裸鼠皮下移植瘤

将Si-P38γ转染Hep3B细胞36 h后，进行裸鼠背部皮下注射，实验分2组：Si-P38γ组和Hep3B组，每只接种细胞数为1×106个细胞，观察各组动物成瘤细胞。接种后观察肿瘤大小，25天后处死小鼠，取肿瘤并测量其大小和重量称量。最后进行肿瘤体积计算:V=长×宽×高×π/6。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 肝癌患者P38γ表达量增加

Western-Blot分析P38γ蛋白表达结果显示：肝癌组织中P38γ表达量显著高于正常组织，具有统计学意义(P<0.001)(图1)。

图1 P38γ蛋白表达检测

2.2 Si-P38γ对P38γ表达的干扰效果

构建P38γ干扰质粒Si-P38γ将其转染至Hep3B细胞，并经Western-Blot分析P38γ蛋白水平发现：随着干扰质粒转染时间的增加，P38γ的表达量呈现下降趋势；并且，在第36 h时，P38γ基本没有表达，见图2。

图2 Si-P38γ干扰P38γ蛋白表达

2.3 Si-P38γ干扰Hep3B裸鼠皮下成瘤情况

将Si-P38γ转染Hep3B细胞36 h后，通过皮下注射至裸鼠，将裸鼠饲养至25天，观察肿瘤形成情况并测量其大小。同时，以Hep3B细胞为对照组。结果显示：Si-P38γ组肿瘤大小和成瘤数量均显著小于 Hep3B组，具有统计学意义(P均<0.001)，见图3。

图3 Si-P38γ干扰Hep3B成瘤

2.4 P38γ蛋白高表达的临床意义

270患者中，P38γ高表达患者116例，P38γ低表达患者81例。P38γ表达与患者年龄、性别无显著相关性(P=0.465，P=0.732)。但是，在肿瘤体积方面，P38γ高表达组肿瘤体积显著大于P38γ低表达组(P<0.001)；同时，在病理分级方面也具有显著差异(P<0.001)，见表1。

表1 P38γ蛋白高表达的意义(例，%)

3 讨论

近年来，由于肝炎疫苗接种以及环境因素的改变和营养条件的改变，年轻人群肝癌患者相对减少了约20%[1]但我国一直都是肝癌发病率最高的国家之一，肝癌在我国发病率第四，死亡率第二[14]。尤其是随着经济条件的改善，中国人群饮酒量在呈现增长趋势，导致酒精性肝病患者人数逐年增加，随之因酒精而导致患肝癌人数也增加。尽管由于肝炎疫苗的接种，以及生活环境的改善，在一定程度上控制了肝癌的发生，但肝癌每年依然造成近80万人死亡，对生命带来致命威胁。肝癌患者的中位生存期一般仅为6～20个月。

研究结果显示，肝癌患者肝组织中P38γ表达量显著高于非肿瘤组织。因此，本研究构建靶向P38γ的干扰质粒：Si-P38γ；并且通过蛋白水平表达分析鉴定其对P38γ表达的干扰效果，结果显示在Si-P38γ转染36小时后，Si-P38γ基本不再表达。基于此，本研究成功构建了P38γ的干扰质粒：Si-P38γ，并且在Hep3B细胞中证明了其具有干扰效果。进一步，本研究又分析了Si-P38γ对Hep3B细胞在裸鼠体内成瘤的影响，结果显示Si-P38γ干扰后影响了Hep3B的成瘤效果，其成瘤数和肿瘤大小均显著减少。

肝癌患者的中位生存期一般仅为6～20个月，目前针对肝癌早期患者，可以进行肝移植让患者的生存期相对延长。但是肝癌患者早期检出率较低，而晚期肝癌患者的治疗手段主要为靶向治疗、化疗等，但目前上市的靶向治疗药效果并不理想。

本研究结果显示下调P38γ的表达量，可以显著影响肿瘤的形成以及肿瘤大小。提示我们P38γ有望成为一个新的治疗肝癌的靶点分子。但是，P38γ对肝癌的作用机制尚需进一步探索。