脊髓损伤后血清miRNA-21表达与损伤程度的相关性分析

王 军，姜利明,皮杨威,马阳阳,赵东旭*

(吉林大学中日联谊医院 1.脊柱外科；2.南湖院区神经内科，吉林 长春130033)

脊髓损伤(SCI)，指由各种原因导致椎管内神经结构 (包括脊髓和神经根) 及其功能的损害,出现损伤水平及以下脊髓功能 (感觉、运动、反射等) 障碍[1]。脊髓损伤后会发生一系列病理生理变化，比如炎症和免疫反应，神经细胞凋亡等[2]，这些变化被认为与基因表达模式的改变有关[3]，而这些改变通常伴随基因网络的转录后调控。在已知的转录后调控剂中，由于具有抑制mRNA翻译的能力，微小核糖核酸(microRNAs， miR)备受学者关注，而且有研究表明 miRNA调节人类基因组中60%的基因[4]。miRNA存在于包括中枢神经系统(CNS)在内的所有系统中，参与调节神经疾病和神经外伤性疾病，例如阿尔茨海默氏症，帕金森氏症和亨廷顿病，图雷特氏综合症和精神分裂症[5]。有一些研究使用微阵列分析检测了脊髓损伤后大鼠和小鼠的miRNA表达谱，这在动物模型中初步证实了几种miRNA发生了显著变化(如miR-21的过表达)，并确定了其中一些调节因子的潜在下游靶点[6-7]。因此，miRNA 可能广泛影响人类脊髓损伤后病理生理反应的信号网络，而miR-21作为动物模型中过表达的调节因子之一，在脊髓损伤患者中的表达水平仍然未知。因此，本研究旨在测定脊髓损伤后不同时间点患者血清中的miR-21水平，并基于损伤后时间、年龄和性别分析miR-21在脊髓损伤患者、非脊髓损伤患者和健康志愿者之间的差异表达模式，为脊髓损伤靶向药物的研究和治疗时机的选择提供参考。

1 资料和方法

1.1 临床资料

选择在2018年9月至2019年9月吉林大学中日联谊医院脊柱外科收治的脊髓损伤患者100例为脊髓损伤组(SCI组)，这些患者都经临床表现和影像学检查确诊无误；非脊髓损伤组(NSCI组)为无中枢神经系统受损的患者，共纳入80例，包括下肢损伤44例，上肢损伤36例；健康组为医院体检中心进行例行检查的人群，共纳入90例，这些人在入组前从未被诊断SCI。三组研究人群进行了年龄、性别比等基本指标的比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经本院医学伦理委员会批准，符合医学伦理学要求，在采集血样之前，都签署了知情同意书。

1.2 损伤程度的评价方法

脊髓损伤病人病情的严重程度与脊髓损伤程度有关，由具有5年以上临床工作经验的脊柱外科医师根据临床表现进行评价。完全性脊髓损伤表现为最低骶髓节段 (S4-5) 感觉和运动功能丧失 (即没有骶残留) ，完全性脊髓损伤应在脊髓休克结束后确定,若脊髓损伤48 h后仍表现为脊髓休克,检查确认鞍区无感觉和运动功能,则按完全性脊髓损伤诊断；如果神经损伤平面以下,包括最低骶髓节段 (S4-5) 保留任何感觉和(或)运动功能 (即存在骶残留)，则判定为不完全性脊髓损伤[1]。

1.3 血清制备

所有研究参与者禁食一夜后，于清晨空腹抽取4 ml外周静脉血。血样在室温下放置60 min。然后在700 g，4℃下超速离心(30 000 r/min)10 min后，立即将血清从血液中分离出来，冷冻并储存在-80℃的冰箱中留待检测。在样品储存期间，避免反复冻融，以确保样品的质量。

1.4 核酸提取和实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)

根据制造商的使用说明书，使用TRIzol (Invitrogen，CA)和miRNeasy微型试剂盒(Qiagen，West Sussex，UK)分离总RNA，这样可以有效地回收所有RNA，包括miRNA；使用NanoDrop分光光度计(ND-1000，Nanodrop Technologies)测量RNA的质量和数量，并通过凝胶电泳确定RNA的完整性；使用引物逆转录试剂盒(日本东京TaKaRa)将每个样品的总RNA反转录成cDNA；使用SYBR Premix Ex Taq(日本东京TaKaRa)和miR-21的miRNA特异性引物(中国广州Ribobio)进行qRT-PCR。将每个样品的相对miRNA水平标准化为U6表达。记录周期阈值(CT)，其定义为荧光信号高于指示基线可变性的阈值所需的聚合酶链反应周期数。基因表达的相对变化用2-ΔΔCt表示，即NSCI组和健康组miRNA-21原始拷贝数的差异。ΔΔCT= SCI组的(CTmiR-21-CTU6)-对照组的(CTmiR-21-CTU6)。

1.5 统计学处理

使用GraphPad Prism 5.01和SPSS 16.0统计学软件进行数据处理和分析。计量资料用均数±标准差表示。统计分析采用双向重复测量方差分析和图基(Tukey)事后检验进行多重比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征

在SCI患者中，存活患者的平均年龄为36.12±3.56岁；48名患者年龄在35岁以上，其他患者年龄在35岁以下；大多数SCI患者(76%)是由交通事故造成的，其余患者因高处坠落而受伤；43%的患者发生颈髓损伤，其他患者发生其他部位的脊髓损伤；有57例发生了完全性脊髓损伤，43例为不完全性脊髓损伤；在整个研究期间，脊髓损伤患者的死亡率为9%。NSCI组患者的平均年龄为39.22±4.45岁(男性56例、女性24例)，其中包括36例手臂损伤和44例腿部损伤。健康组包括55例男性患者，35例女性患者，平均年龄为38.3±2.35。SCI组患者与对照组(NSCI组和健康组)患者之间的年龄和性别分布无显著差异，见表1。

表1 脊髓损伤人群的临床特征

2.2 相关性分析

本研究定量分析了三组人群伤后第1天、7天、28天和3个月血清miR-21的相对表达水平(见图1)。结果显示SCI患者血清miR-21水平在伤后第1天明显升高，在伤后第7天达到峰值，而在伤后第28天，基本与NSCI组及对照组持平，在之后miR-21的水平维持在对照水平。然而，在NSCI和对照组中，血清miR-21几乎没有变化。miR-21的水平与患者性别之间没有相关性(见图2A)。此外，miR-21的表达水平与患者年龄也无相关性(见图2B)。脊髓损伤后第1天和第7天，完全性脊髓损伤组血清miR-21水平明显高于不完全性脊髓损伤组(见图3)，表明血清miR-21水平与损伤程度有关(P<0.001)。

图1 脊髓损伤、非脊髓损伤以及对照组(NSCI和健康志愿者)的miR-21相对表达水平变化。数据用均值±标准误(双向重复测量方差分析和图基事后检验)表示。SCI组与对照组的差异显著性水平用星号表示：*P<0.05，**P<0.01

图2 不同性别(A)和不同年龄(B)的人群脊髓损伤后血清中miR-21的相对表达水平变化

图3 完全性脊髓损伤和不完全性脊髓损伤后血清中miR-21的相对表达水平变化

3 讨论

脊髓损伤根据致病因素分创伤性和非创伤性两大类,创伤性脊髓损伤是最严重的损伤类型之一，交通事故和高空坠落是目前创伤性SCI 的两大主要原因。全亚洲的SCI平均年患病率为12.1-61.6 人次/100万[8]。近年来，脊髓损伤呈现出三高一低的发展趋势，即高发病、高耗费、高致残及低龄化，已成为学术界亟需攻克的重大医疗难题。创伤性脊髓损伤病理生理反应可分为三个阶段，急性期为脊髓休克状态；急性期之后的第二阶段发生在伤后数分钟或数周，包括血管改变，生化紊乱，细胞的炎症反应和死亡；慢性期发生在伤后的数天到数年时间，这一阶段的特征是细胞凋亡，瓦勒变性和瘢痕形成[3,9]。SCI发生后的病理生理变化与基因表达模式的改变有关，一方面，在损伤后的最初几个小时内，与炎症和细胞死亡相关的基因会强烈上调，而与细胞兴奋性和神经传递有关的基因下调；在最初的几周中，与炎症和凋亡相关的基因仍持续上调，而调节细胞骨架排列，髓鞘和突触的基因表达下降，反映出组织完整性受损。另一方面，编码血管生长、神经生成和生长因子分泌的基因表达增加，试图促进神经的存活和再生[3]。因此，改变miRNA的表达可能会极大地影响SCI的病理生理变化过程。在本研究中，我们发现SCI后不同时间点的miR-21血清水平有不同的变化，这进一步表明miRNA可能极大地影响SCI的病理生理和功能结局。

最近，有几项研究证明了多个损伤模型中miR-21的异常表达。例如，微阵列分析表明，在大鼠创伤性脑损伤后多个时间点(6-72小时)测量，许多miRNA的水平都发生了改变，而大脑皮层中的miR-21始终处于高表达水平[10]。Redell等人发现啮齿动物创伤性脑外伤(TBI)后海马中许多miRNA的表达发生了变化，其中miR-21的表达显著增加，表达水平在受伤后3天达到峰值，并在受伤后数天恢复到正常水平[11]。另外，有学者在大鼠体内敲除miR-21后，加重了神经功能缺陷及组织的损伤，增加了大鼠脊髓损伤后细胞的凋亡程度[12]。显然，大部分研究主要是集中于动物模型中miR-21的表达上，这与患者有所不同。我们的研究是以患病人群为观察组，脊髓未损伤人群和健康人群为对照组，发现脊髓损伤后不同时间点的miR-21水平有不同的变化，这可能有助于临床医生在脊髓损伤后选择合适的时间应用适当的药物进行靶向治疗。