单细胞RNA测序在肾脏领域的研究进展

王鑫瑶 邓振领 王悦

北京大学第三医院肾内科 100191

传统的转录组学检测主要对组织或者大量细胞集合体水平进行批量分析，得到的数据是多细胞基因转录的总体水平，常常掩盖了不同细胞之间的差异，很难发现在疾病发展中起重要作用的特定细胞类型。scRNA-seq在单细胞水平分析基因转录，实现对细胞类型及其亚型进行全面分类，鉴定出新的细胞类型及特异性基因，还可以通过拟时序(pseudotime)分析推断出发育过程中细胞的分化轨迹和细胞亚型的演化过程，这些均有助于揭示疾病的发病机制，为临床诊断和治疗提供新思路。本文在阐述scRNA-seq技术在肾脏领域最新研究进展的基础上，重点对常见的多种肾脏病肾组织中免疫细胞scRNA-seq的研究进展进行综述。

一、scRNA-seq技术

scRNA-seq技术主要包括单细胞悬液制备、单细胞分离、文库构建和数据分析4个环节。

1.单细胞悬液制备 制备高质量的单细胞悬液是scRNA-seq成功的关键。对于血液等天然单细胞悬液可使用梯度离心法进行单细胞悬液制备[1]，而对于肾脏等固体组织需要进行网搓和研磨等机械处理方法和消化酶处理，不同组织解离单细胞所需要的消化酶、消化时间、温度和浓度不同[2]。在细胞解离过程中加入脱氧核糖核酸酶Ⅰ可减少因细胞裂解而导致的细胞聚集[2]，将单细胞悬液经过滤网或过滤器可以去除细胞团、细胞碎片和纤维等杂质。此外，单细胞悬液制备要求及时、快速，以免造成RNA降解和应激相关基因活化[3]。

2.单细胞分离 常见的方法有手工挑取法、流式细胞分选法和微流控技术[4]。手工挑取法在显微镜下直视提取单细胞，对实验人员技术要求高，且提取的细胞可能为非目标细胞；流式细胞分选法可以分选目标细胞，且捕获量较大，但耗时长，费用大，可能损伤细胞；微流控技术以其高细胞通量、低样本消耗、低分析成本及精确控制等特点已成为单细胞分离及其cDNA合成的主流手段，2012年以来先后有Fluidigm C1[5]、Drop-seq[6]和InDrop[7]等上市，尤其10×Genomics公司推出的商业化Chromium系统[8]是目前scRNA-seq领域最流行的平台，广泛用于单细胞转录组的测序[9]。

3.文库构建 即构建单细胞cDNA文库，在cDNA扩增前引入UMIs(unique molecular identifiers)或条形码(barcode)可通过消除聚合酶链式反应产生的扩增偏倚，提高数据的准确性及再现性[4]。生成单细胞文库的方法根据cDNA覆盖范围分为产生全长(或接近全长)和产生3′或5′端标签转录序列两种[10]。目前流行的微流控技术例如Drop-seq[6]和Chromium[8]生成的是3′端标签数据，且均引入UMIs，具有高通量和低成本的优势，适用于复杂组织或肿瘤样本的大量细胞亚群鉴定。

4.数据分析 数据分析是通过软件、数据库与算法等进行生物信息学分析[10]，是scRNA-seq产出最终研究结果的关键，包括预处理和主要分析两大步骤，其中数据主要分析是scRNA-seq应用的重点内容。常常用于鉴定新的细胞类型和亚群，通过聚类分析产生的细胞亚群用颜色编码来表示，基因差异程度用距离来表示[11]。将聚类后的细胞亚群进行差异表达分析能确定差异表达基因或标志基因，可反映细胞亚群的特异性[12]。通过拟时序分析单细胞关键基因的表达模式可以模拟细胞分化发育的动态过程，在发育研究中应用较广[13-14]。cDNA全长覆盖数据还可进行等位基因表达、RNA编辑和可变剪接等分析。(图1)

图1 scRNA-seq流程示意图

二、scRNA-seq在肾脏领域最新研究进展

(一)发现更多新的细胞亚型及特异性基因

2019年谢静远教授[15]综述scRNA-seq技术在肾脏领域的应用并报道了之前已经发现的细胞类型及亚型，最近又有新的研究报道。其中包括肾小球、肾小管及集合管的细胞亚型及特异性基因，现分述如下。(表1)

表1 小鼠肾脏细胞特异性基因报道汇总

1.肾小球 Karaisko等[16]对健康小鼠肾小球细胞进行scRNA-seq检测，鉴定出包括足细胞、系膜细胞、内皮细胞在内的肾小球固有细胞、少量免疫细胞及小管细胞，发现了内皮细胞与“细胞黏附”、“细胞成熟”、“应激反应”和“细胞增殖”相关的四个基因亚群，说明内皮细胞存在稳态至激活的不同状态。同时，研究者还发现了新的细胞特异性基因如足细胞的Wsb2、系膜细胞的Pde3a及内皮细胞的Meis2。Fu等[17]对链脲佐菌素诱导的内皮型一氧化氮合酶敲除的糖尿病组小鼠及健康对照组小鼠肾小球细胞进行scRNA-seq，发现了肾小球细胞新的特异性基因如足细胞中的Magi2和Robo2、内皮细胞中Ramp3和Fabp4。Park等[18]通过scRNA-seq建立健康小鼠全肾脏的单细胞转录组的图谱，发现了Cdkn1c和Bcam也可作为足细胞特异性基因。

2.肾小管及集合管 Chen等[19]针对健康小鼠集合管细胞进行scRNA-seq，鉴定出包括主细胞(principle cell，PC)、A型润细胞(A-intercalated cell，A-IC)和B型润细胞(B-intercalated cell，B-IC)在内的三种集合管细胞类型，还发现了同时表达PC和IC特异性基因的一种“混合型”细胞类型。有趣的是，Park等[18]也报道一种同时表达PC和IC特异性基因的亚群，通过拟时序分析证实了这种细胞是IC向 PC转化的中间过渡状态，定义为“集合管过渡细胞”。此外，Park等[18]还发现了肾小管细胞新的特异性基因如近端小管细胞中的Hnf4a和Slc22a12、远曲小管细胞中Wnk1和Emx1。

新的细胞亚型及特异性基因的发现使我们进一步了解肾脏结构，并为设计特异性探针提供依据。

3.揭示更多特定细胞类型的功能 Park等[18]试图分别通过人类单基因遗传和复杂性状基因疾病相关基因的表达定位来推断小鼠肾脏单细胞的功能。他们发现，与人类单基因遗传有关基因相对应的，大多数蛋白尿同源基因仅在小鼠肾小球足细胞中表达，肾小管酸中毒同源基因仅在IC中表达，而血压调节同源基因集中表达在远端小管及集合管细胞中；作为复杂性状基因疾病，慢性肾脏病相关基因主要在小鼠近端小管细胞中表达，与血浆代谢物水平相关的复杂性状基因也表达于近端小管细胞，与血压相关的复杂性状基因则集中表达于足细胞与集合管细胞中。Wu等[20]将全基因组关联分析中复杂性状基因疾病的数据用于分析人类健康肾脏单细胞，发现慢性肾脏病相关基因不仅于近端小管细胞中表达，还富集于足细胞和集合管细胞，血压相关基因不仅富集于足细胞和集合管细胞，还在系膜细胞中表达。scRNA-seq结合基因组相关分析在肾脏单细胞中的研究有助于推断特定细胞类型在生理与病理机制方面的作用。

4.肾脏病中肾组织免疫细胞的研究 几乎所有肾脏疾病都在一定程度上涉及免疫系统的激活，着眼于scRNA-seq在常见的肾脏病肾组织中免疫细胞的研究进展，能更好地了解免疫机制在肾脏疾病发生和发展中的作用，有助于制定新的诊疗策略。

(1)狼疮肾炎(lupus nephritis，LN)：Der等[21]对LN患者的肾脏和皮肤活检组织进行scRNA-seq检测，鉴定出皮肤的角质形成细胞、肾脏的肾小管细胞、皮肤和肾脏均存在的成纤维细胞、内皮细胞及少量T细胞和髓系细胞，发现与健康对照组相比LN患者皮肤角质形成细胞中干扰素(interferon，IFN)诱导的基因如IFI6、IFI27显著增加，LN患者肾小管细胞中IFN信号的水平与蛋白尿的严重程度及治疗反应相关，可以为LN针对IFN及其信号通路的治疗方法提供分子基础。Der等[22]还对治疗反应不同的LN患者肾小管及角质形成细胞进行scRNA-seq，发现对治疗无应答的患者肾小管细胞和角质形成细胞中编码细胞外基质蛋白的基因如COL1A1等表达上调，这与肾小管间质纤维化是LN预后不良的标志相一致[23]。Arazi等[24]建立了LN肾脏免疫细胞图谱，包括髓系细胞、B细胞、NK细胞和T细胞等21个免疫细胞亚群，发现这些免疫细胞常常表达趋化因子受体CXCR4和CX3CR1；LN患者尿液中免疫细胞的基因表达与肾组织中免疫细胞如巨噬细胞和T细胞等高度一致。

(2)糖尿病肾病:Fu等[17]对糖尿病组小鼠和健康对照组小鼠进行scRNA-seq，发现糖尿病组小鼠肾小球系膜细胞和足细胞比例减少，而内皮细胞和免疫细胞比例增加，且增加的免疫细胞主要是巨噬细胞，尤其是M1型，提示M1型巨噬细胞可能在糖尿病肾病炎症反应中起重要作用。

(3)移植肾排斥反应:Wu等[25]对抗体介导的急性排斥反应患者的肾活检组织和健康对照肾组织共8746个单细胞进行scRNA-seq，鉴定出包括大多数肾脏固有细胞和主要免疫细胞在内共16种细胞，其中CD16+非经典和经典单核细胞两个亚群在移植肾组织中显著增加，CD16+非经典单核细胞与树突细胞成熟相关。由于B-浆细胞簇是目前抗体介导的急性排斥反应治疗的主要靶点，研究者还重点分析了B-浆细胞簇，鉴定出免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)低表达的B细胞簇、Ig高表达的多克隆浆细胞簇(成熟B细胞)和产生抗体的Ig高表达的单克隆浆细胞簇，这些发现有助于阐明移植肾急性排斥反应的发生机制。

(4)肾脏肿瘤：肾脏肿瘤中存在免疫细胞浸润，免疫细胞浸润的程度是肿瘤预后不良的独立预测因子[26]。Young等[27]通过scRNA-seq比较了人类肾脏肿瘤、正常胚胎、儿童和成人肾脏单细胞转录组，发现Wilms肿瘤细胞起源于异常胚胎细胞，成人肾细胞癌起源于近曲小管细胞SLC17A3+VCAM1+SLC7A13-亚型。Young等[27]还在肾细胞癌组织中发现一类表达血管内皮生长因子A的巨噬细胞，已知血管内皮生长因子信号通路是肾细胞癌的治疗靶点之一[28]，提示巨噬细胞可能参与肾脏肿瘤的发生发展。

(5)急性肾损伤和肾脏纤维化：do Valle Duraes等[29]通过scRNA-seq建立了小鼠肾脏急性损伤期、修复期和纤维化期三个阶段的肾脏免疫细胞图谱，发现T细胞群是唯一一个在肾损伤早期减少并在损伤晚期显著增加的细胞群，其中调节性T细胞在损伤早期和纤维化期的作用不同，在损伤早期白细胞介素-2和白细胞介素-33介导的调节性T细胞的增加可保护肾脏免于损伤并延缓纤维化的发展，而在纤维化期调节性T细胞则与促进炎症反应和细胞凋亡有关。

三、挑战与展望

scRNA-seq技术的出现和进步无疑带来生物学领域颠覆性发展，但scRNA-seq仍面临很多挑战，高质量单细胞悬液制备和测序深度不足常常导致不能检测到肾脏全部细胞类型及每个单细胞全部转录基因。为了解决该问题，有研究将单核RNA测序与scRNA-seq进行比较，发现单核RNA测序与scRNA-seq相比有相同的基因检测敏感性，且具有解离偏倚低、可采用冰冻样本及较低的人为应激反应等优势[30-31]。但细胞核中的RNA仅占整个细胞RNA的10%～20%[32]，不能反映细胞全部转录本表达，若将二者联合有助于更加全面、深入地阐明单细胞基因转录情况。随着单细胞基因测序在肾脏领域的日益扩展和加深，我们能更加理解肾脏细胞构成、功能及其动态演变，以及各种肾脏疾病的发生发展，更好阐明肾脏衰老和肾脏疾病发病机制，并有助于开发新的诊断及治疗方法。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突