Wnt3a重组蛋白溶剂对脑梗死模型大鼠干预效果及作用机制

袁小冬 赵俊杰 罗孜贤 张宴斌

(杭州市余杭区第一人民医院神经内科，浙江 杭州 311100；2邯郸市第一医院神经内科；3南昌大学第一附属医院高新医院神经内科)

脑梗死是临床中常见的一种脑血管疾病，具有较高的发病率、死亡率及致残率，对人们的身体健康和心理产生严重的危害〔1〕，已经成为全球研究的重中之重。目前在临床中治疗脑梗死主要采用溶栓治疗，神经影像学检查等，但是大部分患者神经功能恢复的效果均不显著〔2〕。Dong等〔3〕研究认为，脑梗死后机体缺血区域神经细胞也会紧跟着发生坏死，周围神经细胞表现为延迟性神经元退变。Wnt信号通路属于一种生长刺激信号通路，其启动信号主要是Wnt蛋白，主要存在于脑组织、海马区等中枢神经系统中，发挥着关键性的作用〔4〕。目前已经有研究证实，Wnt3a蛋白参与脊髓发育过程〔5〕，在脑梗死中作用相关研究较少。本文旨在研究Wnt3a重组蛋白溶剂对脑梗死模型大鼠的干预效果及作用机制，为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 选取30只清洁级SD雄性大鼠，体重240～320 g，均由河北伊维沃生物科技有限公司提供，许可证号：SYXK(冀)2019-008。均在室温22℃、湿度50%环境下饲养，自由饮食和饮水。

1.2实验方法

1.2.1脑梗死模型建立及分组 30只大鼠中选取10只为正常组，其余20只参考田烜〔6〕建立脑梗死模型，具体操作：采用4%的异氟烷将大鼠吸入麻醉后，保证其进行自主呼吸。选择大鼠颈部正中切口，将右侧的颈总、外、内动脉分别分离后，将颈总、外动脉进行结扎，在近分叉位置做一“V”形切口，使用多聚赖氨酸、明胶等处理的1.8号鱼线从切口位置向大鼠右颈内动脉插入，深度为18.5 mm，一直到大鼠大脑中的动脉位置，将血供完全阻止。模型成功标准即大鼠右侧出现霍纳综合征(Horner征)，成功18只，随机分为模型组、Wnt3a溶剂组，各9只。

1.2.2药物干预 Wnt3a溶剂组大鼠给予50 ng/ml Wnt3a重组蛋白腹腔缓慢注射6 μl，正常组和模型组给予等体积的生理盐水进行干预。三组大鼠均连续干预1 w。

1.2.3氧化应激、炎症指标检测 抽取大鼠腹部静脉血3 ml,以3 000 r/min离心速度，离心处理10 min，分离上层血清。采用硫代巴比妥酸检测丙二醛(MDA)水平；采用黄嘌呤氧化酶反应检测超氧化物歧化酶(SOD)水平；采用比色法检测谷胱甘肽(GSH)水平。采用酶联免疫吸附试验检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β水平：将提前稀释好的标准品100 μl加入相应的微孔板反应空中，第1孔只加样品稀释液为零孔。盖上模板混合均匀，在37 ℃下处理90 min，甩去孔内液体，吸干水分；将准备好的抗体(0.1 ml)加入到每孔中，在37 ℃下处理60 min，底物中加四甲基联苯胺(TMS)，空白孔中不加；甩去孔内液体，每孔中加满0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，浸泡1～2 min，甩去孔内液体，吸干水分；每孔中加入90 μl TMS，避光处理15～20 min；每孔中加入90 μl TMS终止液，即蓝色变为黄色。在波长450 mm处分析TNF-α、IL-1β水平。

1.2.4神经功能统计 大鼠神经功能采用Garcia评分〔7〕来完成，得分3～18分，12～18分表示大鼠有轻度神经功能损伤；8～11分表示大鼠有中度神经功能损伤；3～7分表示大鼠有重度神经功能损伤。

1.2.5脑组织病理学观察及脑梗死体积统计 处死大鼠，快速提取大鼠脑组织制作标本，将其置于4%的多聚甲醛中进行固定，制作常规石蜡切片，在浓度0.5%苏木素-伊红染色10 min，自来水冲洗1次；使用乙醇梯度进行脱水处理，最后用中性树胶进行封片。大鼠脑梗死体积=脑梗死面积×切片厚度。

1.2.6Wnt3a、β-catenin蛋白检测 采用Western印迹检测，将采集到的血液标本10 000 r/min离心处理10 min，对上清液进行提取后，BCA进行蛋白定量检测，在2×十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶缓冲液中加入50 μg蛋白，在100℃环境中加热5 min有助于蛋白发生变性。凝胶电泳完、转膜，取膜，4℃环境下在5%脱脂牛奶中固定、封闭处理时间为1 h，将一抗使用0.05%～0.10% TBST给予稀释(Wnt3a、β-catenin一抗为1∶1 000)，4℃孵育过夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，每次为5 min，二抗被0.05%～0.10% TBST稀释(1∶10 000)，摇动孵育时间为1 h，再次采用TBST连续洗膜3次，处理时间为5 min。二氨基联苯胺(DAB)显色，定量分析蛋白表达情况。以GAPDH为内参。

1.3统计学处理 采用SPSS20.0软件行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组氧化应激相关指标比较 与正常组相比，模型组、Wnt3a溶剂组SOD、GSH水平降低，MDA水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，Wnt3a溶剂组SOD、GSH水平升高，MDA水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组氧化应激相关指标比较

2.2各组炎症因子TNF-α、IL-1β水平比较 与正常组相比，模型组、Wnt3a溶剂组TNF-α、IL-1β水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，Wnt3a溶剂组TNF-α、IL-1β水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3各组脑梗死体积、神经功能比较 与正常组相比，模型组、Wnt3a溶剂组神经功能评分降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，Wnt3a溶剂组脑梗死体积减小、神经功能评分升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 各组炎症因子TNF-α、IL-1β水平比较

2.4各组脑组织病理学观察 如图1所示，正常组脑组织神经元、神经胶质细胞结构正常，排列整齐，无肿胀，细胞与血管之间排列紧密；模型组大鼠脑组织中神经细胞数量减少，神经元及神经胶质细胞发生肿胀，细胞与周围血管之间的空隙增大；Wnt3a溶剂组大鼠脑组织水肿明显减轻，神经细胞数量增多。

表3 各组大鼠脑梗死体积、神经功能比较

图1 各组脑组织病理学观察(HE，×200)

2.5各组Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量比较 与正常组相比，模型组、Wnt3a溶剂组Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，Wnt3a溶剂组Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4、图2。

表4 各组Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量比较

图2 各组Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量比较

3 讨 论

研究显示，大部分脑梗死患者梗死灶主要分布在大脑半球中某一区域，其中大脑中动脉是常见的梗死部位〔8〕。郭安利等〔9〕研究认为，氧化应激反应是导致缺血性脑血管疾病发病的主要原因。脑梗死发生会产生大量的氧自由基，氧化应激反应也随之增加，通过对其进行诱导引起神经毒性损伤，导致大量神经元死亡〔10,11〕。SOD属于一种特异性酶对氧自由基具有一定的清除作用，常被用来作为清除自由基的标志物〔12〕。MDA主要通过细胞膜脂质过氧化产生，是一种稳定的代谢产物；GSH与SOD结合在细胞抗氧化中发挥着关键性的作用。本研究结果显示，Wnt3a重组蛋白溶剂能抑制脑梗死模型大鼠氧化应激反应，从而控制其疾病进一步发展。

Wnt信号通路参与多种器官及神经系统形成、构建过程，与神经组织中神经前体细胞的分化、增殖、迁移有紧密的联系〔13〕。曾毅等〔14〕研究指出，在脑卒中发病后Wnt3a信号通路中相关蛋白β-catenin表达上调，提示通过抑制Wnt3a信号通路导致急性脑损伤患者病情加重。脑梗死发病与炎症反应有关，一旦发生脑缺血机体产生大量的炎症反应，氧自由基、兴奋性氨基酸被大量释放，放出有毒物质，对脑组织带来不可逆的损伤，神经细胞大量凋亡，脑损伤严重程度较重〔15〕。TNF-α属于一种重要的炎症反应因子，参与动脉粥样硬化形成过程，加快脑神经细胞凋亡速度。IL-1β能将内皮细胞激活，血栓产生，诱导细胞间黏附分子表达异常，促进中性粒细胞向大脑组织浸润，引起炎症反应，同时也是脑缺血损伤发病的主要病理原因〔16〕。本研究结果发现，Wnt3a重组蛋白溶剂能抑制脑梗死模型大鼠炎症反应发生，减少对脑组织带来的损伤。在临床脑梗死患者中，大脑中动脉阻塞发病率较高，其优势是不需要进行开颅，并且梗死部位较为恒定，具有良好的重复性和稳定性，这一模型的发病与患者临床发病有相似之处〔17〕。本研究结果证实，Wnt3a重组蛋白溶剂能减少脑梗死模型大鼠脑梗死体积，提高神经功能，促进其恢复。

Wnt3a蛋白与其他Wnt蛋白特点有相似之处，其特点主要体现在疏水性，以自分泌和旁分泌方式向细胞外进行释放，可以结合细胞表面受体，将下游的信号相关通路激活〔18,19〕。Wnt3a信号蛋白在神经干细胞向神经元分化过程中发挥着重要作用，促进胚胎干细胞向脊髓背侧中间神经元转化，将Wnt信号通路激活后对神经胶质细胞产生起到一定的抑制作用〔20,21〕。本研究中，Wnt3a重组蛋白溶剂能调控Wnt3a、β-catenin蛋白，将Wnt3a/β-catenin信号通路激活。本研究证实，Wnt3a/β-catenin信号通路激活会抑制氧化应激、炎症反应相关指标，Wnt3a重组蛋白溶剂抑制脑梗死病情发展，促进神经功能恢复与Wnt3a信号通路激活有关。

综上所述，Wnt3a重组蛋白溶剂对脑梗死模型大鼠干预效果显著，能抑制氧化应激、炎症反应，减少脑梗死体积，提高神经功能，其作用机制可能与Wnt3a/β-catenin信号通路有关，为其临床应用提供理论依据。