肺内靶向吸入NGF抗体抑制小鼠体内NGF及TGF-β1改善哮喘气道重塑的作用机制

佘巍巍 孙天寿 吴娟 蒙建凤 唐海丽 宋文娟 李华

(1广西南溪山医院呼吸与危重症医学科，广西 桂林 541001；2桂林医学院附属医院呼吸与危重症医学科)

支气管哮喘(以下简称哮喘)是由多种炎性介质、细胞组分及基因等参与的一种常见的慢性气道炎症性疾病，其发病率及死亡率近期在全球内剧增，严重危害到广大人民的健康。慢性气道炎症引起的损伤和修复的频繁发生会导致气道结构的改变，统称气道重塑〔1〕。气道重塑的特点是气道壁增厚、上皮纤维化、气道平滑肌增厚、血管生成和黏液腺体分泌增加〔2〕。一般来说，气道重塑既往被认为有助于气道高反应性和不可逆的气流限制的形成。严重的哮喘具有明显的病理生理学特征如气道重塑，故会降低药物标准化治疗的有效性〔3〕。当前哮喘气道重塑的治疗方法主要为支气管扩张剂和糖皮质激素。糖皮质激素是一种目前治疗哮喘的最为有效的治疗药物，其能够缓解出现支气管哮喘的临床症状、减轻哮喘的气道炎症反应，但是对于早已经形成的气道结构改变如气道重塑却是较难有效〔4〕。目前相关研究报道认为，肺神经生长因子(NGF)能增强气道壁的气道重塑及高反应性，抗NGF可以抑制气道高反应性、抑制气道重塑，并能减少哮喘的气道重塑相关炎症介质的产生〔5〕。然而，肺内吸入抗NGF后在气道重塑中的主要病理变化、作用机制及疗效目前尚不清楚。本研究旨在探讨肺内靶向吸入NGF抗体抑制哮喘气道重塑小鼠体内NGF及转化生长因子(TGF)-β1的作用机制。

1 资料与方法

1.1实验动物 体健BALB/c雌性小鼠的8～10周龄18只，随机分为对照组、支气管哮喘组、靶向吸入抗NGF组，由桂林医学院动物实验中心管理并喂养。所有的小鼠处于一个恒温(22～24℃)恒湿(50%～55%)的环境中，房间内进行昼夜交替控制。

1.2主要试剂及器材 鸡蛋卵蛋白(grade V，A5503；Sigma，St.louis，MO，USA)；SABC法试剂盒；氢氧化铝；生理盐水；鼠多克隆TGF-β1抗体(Abcam co.，Cambridge，UK)；β-actin抗体(1∶1000，IHC，Fremont，CA)；TGF-β1试剂盒；漂烘片机；显微镜(日本奥林巴斯学工业株式会社生产)；高速离心机；凝胶扫描成像系统。

1.3操作方法

1.3.1哮喘气道重塑 动物模型参考Li等〔6〕及Vanacker等〔7〕的方案并做适当改进，由卵清蛋白(OVA)及氢氧化铝凝胶制成的混合溶液(包括200 mg氢氧化铝凝胶+OVA 10 mg并且采用经腹腔内注射在第1天和第7天)进行致敏，对照组的小鼠给予同等剂量的无菌磷酸盐进行干预，该步骤将导致气道高反应性增加、气道炎症及Th2细胞因子的产生，达到急性期的目的。小鼠置于雾化箱里，反复将OVA液雾化吸入(5% OVA液进行雾化30 min，3次/w)第35～71天时把小鼠进行处死后，通过激发和诱导的方法而创建哮喘小鼠动物模型。靶向吸入抗NGF组将抗NGF液进行肺内雾化干预，每天1次，每次40 min(于第14～71天操作)，于每次哮喘小鼠吸入OVA液操作激发之前半小时再行抗NGF液的靶向吸入干预。将100 μg/ml抗NGF应用于小鼠模型。抗NGF组管理的抗NGF抗体(4 ml/kg)在无菌1∶1 000磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，上述操作都在哮喘小鼠进行OVA液雾化激发前3 h。在使用OVA液操作激发前约3 h，哮喘小鼠模型使用4 ml/kg的PBS溶液预处理。小鼠的干预试验的流程图、干预时机和抗NGF液及浓度剂量均参考既往的试验研究〔8〕。对照组将采用类似的实验步骤进行并给予无菌PBS液进行对比。将各组小鼠的肺给予原位分子杂交的方法进行检测。

1.3.2肺组织病理标本制作 取水合氯醛，行腹腔内注射进行麻醉以后，打开胸腔，先经左心室而插管到达小鼠的升主动脉，然后用生理盐水冲洗后采用多聚甲醛灌注而固定。迅速取出其肺部组织进行标本的制作，将肺组织先放置在多聚甲醛溶液中进行固定，然后进行石蜡包埋及切片，由病理医师进行观察。

1.3.3免疫组织化学实验 病理切片经过石蜡包埋处理之后，现行滴加了山羊血清在室温下封闭20 min，按照亲和素生物素-过氧化物酶复合物方行免疫组化实验，然后依次进行孵育操作：①兔TGF-β1抗体及抗NGF的稀释溶液中，保持在4℃的环境中给予过夜；②给予生物素标记羊抗兔IgG抗体浸泡，放置在室温条件下约2 h；③并行链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物在室温下放置1 h。给予PBS液进行漂洗5 min，然后再漂洗3次。接下来用二氨基联苯胺予显色的工作，然后对其给予苏木素复染。最后将标本予以脱水、透明并行中性树胶予以封固，做成切片采用光镜进行观察。阴性对照组的相关试验采用PBS代替上述的抗体而进行实验。

1.3.4进行原位分子杂交检测 原位分子杂交检测的方法为Arrigucci等〔9〕中采用的方法进行操作。对肺TGF-β1和NGF及各自的mRNA的基因表达水平差异性进行比较分析。其各自核苷酸的探针序列为：5′-CCACACGCTGACACTGTCACACACCGAG AA-3′，5′-GCTGTGATCAGAGTGTAGAACAACATGGAC-3′，5′-TATCCGGATAAACCGCCAGGCAGCCTGCTT-3′。基因分析的方法予按常规操作方法和步骤进行，设置阴性对照的切片进行对比分析。常规处理上述切片后，滴入稀释的胃蛋白酶和枸橼酸，在温度37℃条件下消化20 min，采用专用的原位杂交PBS液里进行洗涤5 min，反复重复3次。在42℃的温度情况下的湿盒中再次滴加预杂交液并孵育4 h后，进而滴加已准备好的杂交液，在同样42℃的温盒内完成杂交过程并且过夜，采用在37℃温度条件下由标准的枸橼酸盐溶液进行洗涤3次共5 min，在0.5×SSC培养基溶液中洗涤1次约15 min，在0.2×SSC培养基溶液中洗涤1次约15 min，然后再滴加封闭液，静置30 min后，然后把鼠抗地高辛液滴入其中并静置60 min，然后在PBS溶液中洗涤5 min共4次，再滴加到链霉亲和素-生物素复合物(SABC)液中，然后给予滴加生物素化过氧化物酶，在37℃的温度下静置40 min，在PBS溶液中洗涤4次共 5 min。采用DAB正常程序脱水，并透明，平行DPX的方法封口，然后在光镜条件下观察。其中对照组采用PBS溶液代替以上的抗体来做对比试验。

1.3.5影像分析方法及研判 测量每6个视野的阳性系数及灰度值并进行分析，采用axioplan2的图像处理系统来对原位杂交切片进行处理以利于进行统计学处理。根据邢传平等〔10〕所描述的计算方法进行阳性系数的计算。TGF-β1、NGF和mRNA的阳性细胞经过细胞染色成为阳性颗粒主要表现为棕色或棕黄色。

1.4统计学分析和处理方法 采用SPSS19.0软件进行LSD-t检验、方差分析、Mann WhiteneyU法、Kruskal-WallisH检验。

2 结 果

2.1各组NGF蛋白和NGF mRNA在肺组织中的表达情况比较 支气管哮喘组NGF蛋白及mRNA平均阳性系数明显高于对照组、靶向吸入抗NGF组(t=4.58、4.28、4.19、4.36，均P<0.01)。支气管哮喘组NGF蛋白及mRNA灰度值明显低于靶向吸入抗NGF组、对照组(t=25.9、20.1、49.8、16.8，均P<0.01)。见表1。

2.2TGF-β1蛋白及mRNA的表达 支气管哮喘组TGF-β1 mRNA及蛋白平均阳性系数明显高于靶向吸入抗NGF组、对照组(t=3.98、4.22、4.26、4.21，均P<0.01)，平均灰度值明显低于靶向吸入抗NGF组、对照组(t=31.16、21.56、42.06、15.36，均P<0.01)，见表2。支气管哮喘组的肺内气道上皮及周围部分有较多的以TGF-β1蛋白为主的阳性细胞存在，但是靶向吸入抗NGF组则明显弱表达(TGF-β1蛋白为主的阳性细胞则明显减少)，对照组则仅见少量阳性细胞。

表1 各组肺组织NGF mRNA及蛋白的平均灰度值和均平阳性系数比较

表2 各组TGF-β1蛋白和TGF-β1 mRNA平均阳性系数及平均灰度值比较

3 讨 论

支气管哮喘为常见的慢性气道过敏性和气道炎症性疾病，哮喘的气道炎症的发生、调控和气道的神经系统相互之间有着非常复杂的关系。已有研究提示哮喘的NGF和受体酪氨酸激酶(Trk)A抗体比正常组显著增高〔11〕。哮喘组其血清及肺泡灌洗液检验结果均比NGF组有明显增加〔12〕。近期多位学者和研究〔13，14〕都表明TGF-β1可以明显促进哮喘气道炎症发展，并且发现哮喘组小鼠血清及支气管肺泡灌洗液(BALF)中TGF-β1浓度显著高于对照组。其是通过趋化激活中性粒细胞等炎性细胞共同参与哮喘气道炎症的产生，并在气道炎症的持续及放大中起到非常重要扩增作用，这提示TGF-β1在支气管哮喘气道炎症的发病机制中发挥着非常关键的作用〔15〕。根据本研究推断哮喘小鼠发作时可能是由于肺组织TGF-β1 mRNA的表达增多和TGF-β1的产生增加所导致的。通过靶向吸入抗NGF液后可以显著的降低支气管哮喘小鼠模型肺内TGF-β1-mRNA的表达水平，提示靶向吸入抗NGF可能是通过降低TGF-β1的表达水平这一信号通路而参与到支气管哮喘发病机制中去的。反之，NGF可能是通过增加了哮喘小鼠肺组织内的TGF-β1-mRNA其肺内的表达量进而调控和参与到支气管哮喘的发病机制中去的。从研究中我们发现，和对照组小鼠来相比较，哮喘组小鼠的肺组织(大多为免疫性炎性细胞和气道的结构细胞)，其肺内NGF蛋白及NGF mRNA的表达水平较对照组小鼠有显著增加，其NGF蛋白及NGF mRNA的表达水平增高的主要原因可能是由支气管肺组织炎症细胞合成增加而引起的。同时，靶向干预性吸入抗NGF抗体，抗体均匀分布在受损的气管黏膜的表面，可以达到抑制NGF的生物活性和NGF mRNA的生物活性作用，从而达到促进受损黏膜修复的目的，进而能有效地抑制TGF-β1在肺内的分泌及合成。因此，就哮喘的神经源性气道炎症发病机制本研究推测其可能是由恶性循环链所推动进行的：可能是由于支气管哮喘小鼠的气道上皮细胞和肺组织内的炎症因子(如嗜酸性粒细胞和肥大细胞等)其自身合成的NGF成分明显升高，同时刚刚合成的NGF的又过来刺激炎性因子生长TGF-β1等明显增多，TGF-β1将又作用于气道的效应细胞(如气道平滑肌细胞、上皮细胞等)，导致激发哮喘的神经源性气道炎症。与此相反的是由于气道神经源性炎症反应加重又明显调高肺内NGF的表达水平，正是因为这些循环的反应导致哮喘恶性循环。本文通过靶向吸入抗NGF干预进而作用气道内上皮细胞等效应器官抑制NGF的相应生物活性，又进而抑制肺内TGF-β1的合成和分泌，因此可以减少支气管哮喘的气道高反应性和气道炎症反应等。最近的一项研究中，Schuliga等〔16〕报道哮喘急性加重期的肺内TGF-β1蛋白含量明显高于临床缓解期和正常组，与此同时，严重哮喘和哮喘持续状态下的肺内血清TGF-β1的浓度则更高，与之相反的是，如果哮喘患者的病情如相对越轻，则其发作的持续时间则相对越短，其TGF-β1浓度则相对越低。国外学者在研究中发现，NGF在哮喘这类慢性过敏性呼吸道疾病的高水平，NGF既可以增加气道过敏性炎症，同时又触发气道高反应性，而且在肺部病理组织中有胶原蛋白显著高表达的特点〔17〕。同时也通过TGF-β1/smad的独立信号通路进行信号通路的转导，哮喘小鼠的肺组织内的NGF水平明显增高，且在过敏性哮喘小鼠的肺组织内NGF水平明显比非过敏性哮喘小鼠高。对哮喘模型鼠进行抗NGF干预，结论提示其不仅可能显著减轻气道高反应性，以上文献调研结果都与本研究结果一致。为何会出现上述结果，本研究推测靶向吸入抗NGF的主要优势在于，在支气管哮喘的气道炎症发生发展过程中，暴露于受损气道内皮层的神经末梢的相对生长能被靶向吸入抗NGF而直接抑制，靶向吸入抗NGF主要抑制了气道表面及肺内神经递质的生成，众所周知，神经递质多由肺内的神经元经受刺激而诱发的神经反射而释放。因而靶向吸入抗NGF可以减少神经反射受刺激而诱发感觉神经元生成各种的具有生物活性的神经递质，进而减轻了外源性刺激哮喘小鼠的气道及其周围的靶细胞(比如气道炎性细胞和气道结构细胞)的作用效果，达到减轻气道炎性介质的生成和气道高反应性的形成，减缓气道重塑的发展。NGF作为TGF-β1的上游炎症因子，可以调控TGF-β1的产生和释放。TGF-β1刺激气道平滑肌细胞分化为更多的肥厚和收缩性功能的表型〔18〕。TGF-β1信号受到激活以后可以导致气道成纤维细胞增多及平滑肌细胞的增生。

在哮喘的神经免疫性炎症发病机制的NGF发挥的作用可能如下：在支气管哮喘的气道炎症的发生过程中，气道旁及肺内的靶细胞常因气道炎症而促进了NGF的显著增强。①NGF可以刺激机体的免疫细胞，体内免疫功能进而出现紊乱。②通过突触运输NGF到达背根神经节细胞而聚集储存。神经肽类物质SP/CG明显增多，是由于神经节细胞被刺激而产生的。同时通过气道的平滑肌细胞及上皮细胞等效应细胞进而激发哮喘的神经源性炎症反应的发生，反之，气道炎症能通过释放更多的NGF，故又形成了恶性循环。综合上述的文献及实验结果分析，本研究提出NGF可能通过调控哮喘气道炎症细胞的分泌和合成，进而促进了TGF-β1的分泌和生成，并参与调控哮喘的神经源性气道炎症机制的发生和发展。在本研究中靶向吸入抗NGF的干预作用下可以下调了TGF-β1 mRNA表达和TGF-β1蛋白表达水平，从而降低哮喘其气道炎症；进而参与支气管哮喘的整个病理和生理过程中，总之，本研究提示靶向吸入抗NGF抗体能抑制哮喘的哮喘气道炎症过程，故有利于哮喘气道炎症的控制和治疗，为哮喘防治提供了新的思路。