乌头内生细菌具有抑菌活性物质的理化性质研究

玛依拉·吐尔地别克

(伊犁师范大学，新疆 伊宁 835000)

植物内生细菌是指能够在健康植物组织内繁殖，且与宿主植物建立共生关系状态的一类微生物，具有生物防治、植物促生长和内共生固氮等作用[1]。通常由于内生细菌与宿主植物存在长期的共生关系，从而造成这类细菌的种群结构及生物学功能不同于其土壤细菌和植物根际细菌，其中，可与宿主植物产生相同或相似的次生代谢产物为这部分内生菌的特点[2]。国内外研究发现，目前大部分药用植物生长周期长，提取有效成分步骤繁琐，生物药学资源量较少，对于和植物产生共生关系的内生微生物的生长周期短，最重要的内生菌可产生与宿主植物相似的一些次级代谢产物，可以有效利用微生物来产生具有药用价值的次级代谢产物，也可丰富生物资源[3]。作为中药的乌头类植物，具有良好的镇痛抗炎、抗休克、扩张外周血管、抗氧化等作用。目前对于乌头的研究报道常见于其药效、有效药用成分的提取、毒性、种植、田间管理和病虫害的防治等[4]。综上述研究可知，许多植物中的天然化合物与其内生菌具有密切联系，甚至是内生细菌的次级代谢产物，这也就造成国内外学者陆续加强对植物内生菌的研究，由此发现植物内生细菌产生抗癌物质，为解决抗癌药物的供应问题开辟一条新道路。从上述研究结果可知，乌头的许多化学成分均具有抗肿瘤、抗菌和镇痛等生物学活性，且表现广泛，具有良好的开发潜力。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用供试菌株YACX-1、YACX-2、YACX-3的3株菌株为具有抑菌活性内生细菌，指示菌为大肠杆菌(Escherichiacoli)CGMCC1.1103株，枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC1.769，均由伊犁师范大学生物与地理科学学院微生物实验室保存。主要培养基为NB培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的活化

将实验室所保藏的已分离、纯化保存的3株内生细菌种接于NB固体培养基中，37℃培养，连续培养活化3代，并储存于4℃冰箱备用。同时将作为指示菌的大肠杆菌、枯草芽胞杆菌的单菌落分别接种于LB培养基上，于37℃下培养，并储放于4℃冰箱，备用于抑菌试验。

1.2.2 具有抑菌活性内生细菌发酵液的制备

将活化好的3种菌株接种于NB液体培养基中培养后，8000r·min-1，20min，取上清液，置于4℃的冰箱中保存并使用。

1.2.3 不同发酵条件对抑菌活性物质的影响

在NB培养基上接种活化好的3种菌株，分别将温度为28℃、37℃、42℃和pH设置为6.0、7.0、8.0，其中培养时间可分别设置成16h、24h，再离心收集上清液，用0.22μm过滤器过滤除菌，将100mL发酵液用旋转蒸发仪浓缩至1mL后观察抑菌圈大小。

1.2.4 不同热处理和不同pH对菌株产抑菌物质抑菌活性的影响

吸取100μL供试菌菌悬液加入平板表面，用涂布器将菌液涂布均匀。在温度和pH的处理中将具有抑菌活性乌头内生细菌的3种菌株发酵液分别置于温度45℃、60℃、80℃、100℃下热处理10min，设置pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，过夜培养。之后即可采用纸片法对不同菌株设置2个重复，将纸片放入含有指示菌的待测培养皿中，放置于37℃下，过夜培养，并用游标卡尺测抑菌圈直径并记录。

2 结果与分析

2.1 具有抑菌活性乌头内生细菌发酵液随不同pH值、时间及温度的变化情况

在3种菌株分别对2种指示菌的抑菌活性的检测中由图1至图3中可知，YACX-1、YACX-2、YACX-3等3株菌株的发酵液在pH值为7，时间为16h时抑菌效果最佳。在最适pH和时间为基础的情况下，可将温度分别调节设为28℃、37℃、42℃时，可得出菌株的最适生长温度为37℃。由此可表明，具有抑菌活性乌头内生细菌最适生长条件为37℃，pH值为7，时间为16h。

图1 28℃下3株具有抑菌活性乌头内生细菌的抑菌活性

图2 37℃下3株具有抑菌活性乌头内生细菌的抑菌活性

图3 42℃下3株具有抑菌活性乌头内生细菌的抑菌活性

2.2 具有抑菌活性乌头内生细菌对热处理的稳定性

具有抑菌活性乌头内生细菌经过不同的温度处理时，其抑菌大小(mm)效果的变化如图4可知，YACX-1、YACX-2、YACX-3所产抑菌物质在45℃抑菌效果最好，抑菌圈分别可达到8mm、10mm、9mm，在60℃、80℃和100℃，10min处理后有所降低。综上所述，YACX-2菌株抑菌性耐高温，故而在后期的内生细菌次生代谢产物中可有效利用并进行研究。

图4 不同温度下具有抑菌活性乌头内生细菌抑菌活性稳定性检测

2.3 具有抑菌活性乌头内生细菌对pH稳定性

具有抑菌活性乌头内生细菌对不同pH的稳定性如图5所示，在pH值为4时，YACX-1、YACX-2和YACX-3均无生长；对大肠杆菌的抑菌效果从强到弱为，在pH值为5时，YACX-2>YACX-3>YACX-1；在pH值为6时，YACX-2、YACX-1>YACX-3；在pH值为7时，YACX-2>YACX-3>YACX-1；在pH值为8时，YACX-3>YACX-2>YACX-1。对枯草芽孢杆菌的抑菌效果从强到弱为，在pH值为5时，YACX-3>YACX-2>YACX-1；在pH值为6时，YACX-1、YACX-2>YACX-3；在pH值为7时，YACX-2>YACX-1>YACX-3；在pH值为8时，YACX-2>YACX-3>YACX-1。综上述可知，具有抑菌活性乌头内生细菌在酸性条件下不易生长，却较为耐碱，这可为内生细菌的活性物质的研究打下基础。

图5 具有抑菌活性乌头内生细菌对不同pH抑菌性的检测

3 讨论

在本试验中，对具有抑菌活性乌头内生细菌抑菌活性的最佳发酵条件的优化包括对温度、pH、时间的研究。分别将培养温度设为28℃、37℃、42℃，pH为6、7、8，培养时间为16h、24h的条件下采用纸片法测定抑菌圈的大小。结果可知，菌株的最适培养条件为37℃、pH值为7、时间为16h。在对于具有抑菌活性乌头内生细菌的生物学特性研究中，其YACX-1菌株具有良好的热稳定性，耐高温，抑菌活性也较为稳定，而乌头内生细菌在碱性条件下抑菌活性由强到弱依次为YACX-2>YACX-1>YACX-3。由此可知，乌头内生菌耐碱、耐高温，故而可在后期研究中有效利用乌头内生细菌次级代谢产物，并用于药用植物乌头活性成分的分离提取与纯化，这也恰恰表明了乌头许多有效成分表现广泛，具有较好的开发潜力，可为抗肿瘤、镇痛和抗菌性等打下良好的基础，且表明了乌头内生细菌具有重要的开发价值，为寻找具有抗菌、耐高温的活性次生代谢产物可有效利用提供参考依据。