布鲁氏菌病不同血清学检测方法结果分析

王 斌，王淑芳，白天俊，何金桂

(天祝县动物疫病预防控制中心，甘肃 天祝 733299)

布鲁氏菌病(Brucellosis,以下简称布病)是一种由布鲁氏菌引起的严重危害人民健康和畜牧业发展的人畜共患传染病，是《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病,世界动物卫生组织和我国将其列为二类动物疫病。据报道全球每年发病人数在50万以上。染疫的家畜是人间布病的主要传染源，人由于接触患病的牲畜及其产品或其污染物而感染布病。近几年，我国人、畜间布病疫情呈增长事态，虽然不同地区采取了不同的防控措施，但布病检出率还是高高低低，没有明显下降趋势。

布病的实验室诊断方法有许多种，包括细菌培养、PCR检测和血清学检测。前两种方法耗时长、费力、环境要求高、成本也高，不适合临床检测和调运检疫检测，因此基层检测布病主要用血清学方法。布鲁氏菌侵入机体后，不断刺激机体产生抗体，所以检测血液里的特异性抗体对诊断有重要意义，目前应用比较多的血清学诊断方法有3种，即虎红平板凝集实验(RBT)、试管凝集实验(SAT)、ELISA抗体检测，ELISA检测目前有竞争(cELISA)和间接ELISA(iELISA)两种方法，其中SAT是我国以往确诊布病方法之一。几种方法各有优劣，敏感度和特异性都不同，为了找出更适合牛羊布病临床检测的方法，笔者选用SAT、RBT、cELISA 3种方法检测几群流产羊群布病抗体，并作对比分析。

1 材料与方法

1.1 血清来源

收集2年内各乡镇流产羊群采集的血清共260份，-20℃保存备用。

1.2 试剂

RBT和SAT抗原及阴阳对照血清均来自哈药集团生物有限公司，稀释液自配；cELISA为布鲁氏菌竞争ELISA抗体检测试剂盒，厂家为广州悦洋生物技术有限公司。

1.3 检测方法

检测方法均采用GB/T 18646—2018规定和试剂盒要求。

1.3.1 RBT 先将样品和阴阳血清及抗原恢复到室温，混匀抗原和血清，分别吸取25μL加于反应板上，用移液器吸头快速混匀血清和抗原，涂成圆形，4 min内在自然光下观察。阴阳对照结果成立时方可判断。4 min内出现肉眼可见凝集现象这判断为阳性，无凝集现象者判断为阴性。

1.3.2 SAT 配制0.5%石碳酸的10%氯化钠溶液作稀释液。每份血清用4支凝集试管，第1管加920 μL稀释液，第2～4管各加入500 μL稀释液，然后取血清80 μL加入到第1管内，混匀后吸取500 μL加入到第2管，并充分混匀，如此倍比稀释到第4管，从第4管弃去混匀液500 μL。然后每管加入试管凝集抗原500 μL，同时作阴阳对照管和抗原对照管、比浊管，将各试管混匀后放置37℃恒温箱内孵育18～24 h，判断以1∶50血清稀释度出现“++”以上凝集现象时，判定为阳性，1∶25血清稀释度出现“++”以上凝集现象时，判定为可疑，无凝集现象者判为阴性。

1.3.3 cELISA 试剂盒恢复到室温后取出抗原包被板，以1x洗涤液洗涤1次并拍干，将血清和阴阳对照分别以50 μL加入到ELISA板，再每孔加入50 μL已稀释好的单克隆抗体，混匀5 min，37 ℃孵育30 min。用洗涤液洗板3次拍干，再加入稀释好的羊抗鼠酶标抗体100 μL，37 ℃孵育30 min,再次洗板3次，然后加入底物液各50 μL，室温避光反应15 min,再每孔加终止液50 μL，15 min内用酶标仪测定OD450nm。

结果判断：当样品的PI≥30%时，为布病抗体阳性，样品PI<30%时，为布病抗体阴性。

1.3.4 统计方法 采用Kappa一致性评测方法统计3种结果的一致性。按照标准，Kappa系数的强弱代表一致性的强弱，系数越大，代表一致性越强。当k值<0，表示一致性极差，K值>0.6，表示一致性相当可靠，当k值为0.81～1.0时，表示一致性极强。

2 结果与分析

按照布病防治技术规范，RBT检测阳性而SAT阴性的，经30 d后再采样检测，转阳的或仍然可疑的按照阳性判断，对样品中可疑的重新采样检测，转阴的，按照阴性判断。2018版诊断技术规定SAT和cELISA都可为布病确诊标准，所以笔者以SAT和cELISA为标准，RBT与它们对比结果假阳性率、假阴性率、符合率、敏感度、特异度和Kappa值，形成结果见表1、表2，SAT与cELISA对比一致性和K值，结果见表3。

表1 RBT与SAT检测结果对比

表2 cELISA与RBT检测结果对比

表3 SAT与cELISA检测结果对比

2.1 分析3种检测方法的一致性

三者的符合率均在88.8%以上，用Kappa值检验，K值均大于0.76(0.76～0.88)，说明三者有较高的一致性，其中cELISA与RBT结果相比K值最高，达到0.88，符合率也高达94.6%，而RBT与SAT检测结果K值差点，低了0.12。

2.2 分析三者的敏感度和特异度

以RBT检测结果对比其他两者结果，cLEISA的敏感度高于SAT，达到了100%，特异性也高出SAT6.6个百分点。如果以SAT作为标准判定，RBT的假阳性达到14.9%，容易误判假阳性畜，造成不必要的经济损失，如果以cELISA为标准，CELISA的阳性检出率在两者之间，高于SAT低于RBT。RBT的假阳性率比前者低为8.23，低了7.57个百分点，误判假阳性畜的比例低，并且特异性达到91.7%，高于表1组，说明漏检几率也更低。

2.3 SAT与cELISA检测结果对比分析

虽然从表3看两者K值达到0.85，呈高度一致性，符合率为93.5%，但还是有些差别，没有完 全一致。

3 讨 论

3种检测方法中，RBT方法简单快速易操作，是猪、牛、羊布鲁氏菌病检疫的国标方法。但是溶血现象、交叉反应和超过4 min容易出现纤维素的凝集块等原因会造成假阳性的凝集，导致假阳性较高，特异性不强，容易误判假阳性畜，也无法区分野毒感染抗体和免疫抗体，致使RBT不能作为确诊判断标准[1]。SAT法能定量检测抗体的凝集滴度，尤其对感染初期产生的IgM比较敏感，能很好地检测感染初期和疫苗免疫后血清抗体的早期诊断，特异性也强，但检测耗时长，需要20 h以上，判断时受主观因素影响大，不适合大批量检疫检测使用。ELISA法检测，可根据最后一步颜色的深浅定性或定量判断。据报道，ELISA法检测lgG敏感度高，已被OIE定为判断方法之一[2]。cELISA适合牛种、羊种和猪种布鲁氏菌病的血清学诊断，从以上实验得出结论，cELISA与其他两种方法有高度一致性，敏感度和特异性都强，耗时达2 h左右，操作方便，与SAT相比更适合临床使用，即先用RBT广泛筛选，再用cELISA确诊，尤其针对种畜检测，可避免误判假阳性畜和假阴性畜，减少不必要的经济损失和生物安全危害。