LncRNA PVT1及PD-L1表达与顺铂耐药上皮性卵巢癌临床病理特征及预后的相关性分析

李幸 魏雪晴 王丽 张坦 潘毅 陈颖 忻晓洁

顺铂耐药性上皮性卵巢癌（cisplatin resistant epi⁃thelial ovarian cancer，CREOC）是恶性度较高的妇科肿瘤［1］，紫杉醇联合卡铂为其一线治疗，尽管最初有效，但因化疗耐药性的发生，许多患者可在短期内复发，因此解决此类患者的化疗耐药性问题非常重要。研究表明，长链非编码RNA（long non-coding ri⁃bose nucleic acid，LncRNA）与卵巢癌的发生发展密切相关［2］。目前，在肿瘤免疫治疗中程序性死亡受体-1（programmed cell death-1，PD-1）/程序性死亡配体-1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）亦备受关注，PD-L1可通过与PD-1受体结合，加速卵巢癌的进展［3］，且研究表明LncRNA 与PD-L1在促进卵巢癌进展中起着协同作用［4-5］，而作为LncRNA 的浆细胞瘤异 位 基 因1（plasma cytoma variant translocation1，PVT1）在卵巢癌的发生发展中是否与PD-L1 有协同作用有待进一步证实。本研究旨在探讨CREOC中的LncRNA PVT1和PD-L1的表达，为CREOC 患者的化疗耐药性问题寻找新的突破口。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 收集2014年1月至2017年12月139 例于天津医科大学肿瘤医院经病理诊断为上皮性卵巢癌患者的临床病理资料，均为术后首次辅助化疗结束后6 个月内复发的CREOC 患者作为试验组，选取58 例良性子宫疾病行双侧输卵管卵巢切除术的围绝经期妇女的正常卵巢组织作为对照组。所有患者均采用国际妇产科联合会（FIGO）分期（2009年）进行分期。纳入标准：1）初治并经病理证实的卵巢上皮性癌；2）初次治疗的术式为根治术或满意的肿瘤细胞减灭术；3）肿瘤组织标本均为初次手术时获取；4）所有患者在初次手术后均接受以铂类为基础的一线化疗；5）根据无治疗间隔时间（treatment free interval，TFI）定义复发类型：TFI≤6个月定义为铂类耐药复发，TFI>6 个月定义为铂类敏感复发；6）根据复发类型判断患者对铂类药物的敏感性：TFI≤6个月定义为对铂类耐药，TFI>6 个月定义为对铂类敏感；7）病例随访资料完整。排除标准：1）既往有其他恶性肿瘤病史；2）术前行放化疗等辅助治疗；3）随访资料不完整。

1.1.2 主要试剂 PCR 试剂盒及LncRNA PVT1 的PCR 引物均购自日本Takara 公司，PD-L1 购自荷兰CST有限公司，免疫组织化学法检测试剂盒购自美国Biolengd公司。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR 检测 实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR）扩增条件为95℃15 s、51～58℃（根据各基因不同）15 s、72℃45 s，共40个循环。目的基因的相对表达量采用2-ΔΔCt法，其中-ΔΔCt=ΔCt（标准基因）-ΔCt（目的基因）。LncRNA PVT1引物序列：上游为5'-TGAACTGTCCTTACGTGAC C-3'，下游为5'-AGAGCACCAAGACTGGCTCT-3'。

1.2.2 免疫组织化学法检测 将石蜡包埋的组织行连续切片，厚度为4 mm，在121℃、0.1 mL柠檬酸盐缓冲液（pH为6.0）中高压灭菌处理10 min。使用3%H2O2孵育5 min，阻断切片中的内源性过氧化物，再用0.5%山羊血清阻断60 min后，将切片在4℃下与PD-L1孵育过夜，ELPS试剂盒检测，苏木素复染上色。以同型相合的单克隆抗体替换一抗为阴性对照。阳性结果评定采用半定量积分法，以出现棕色颗粒作为阳性标准。染色强度评分：无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞的计数是在显微镜高倍镜下随机选取10个视野，每个视野中计数100个细胞。细胞阳性率评分：阳性率<25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。染色强度与细胞阳性率乘积结果：0为阴性，1～4为低表达，5～8为中表达，9～12为高表达。

1.2.3 随访 所有患者随访至随访期结束或死亡。无进展生存（progression-free survival，PFS）期定义为从初次手术后完成辅助化疗之日至出现疾病复发或进展，或最后1 次随访为止的时间。总生存（overall survival，OS）期是从初次手术后完成辅助化疗之日至死亡或最后1次随访日期。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。分类变量采用χ2检验或Fisher 确切概率法。组间差异采用独立样本t检验。采用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析，Cox 比例风险回归模型进行多因素生存分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CREOC患者的临床病理特征

139例CREOC患者的相关临床病理特征见表1。

2.2 CREOC组织中LncRNA PVT1和PD-L1的表达

RT-qPCR 检测结果显示，CREOC 组织中的Ln⁃cRNA PVT1 平均表达为1.87±0.61，显著高于正常卵巢组织的1.12±0.28（P<0.001）。免疫组织化学法检测结果显示CREOC组织中的PD-L1表达率（46%）明显高于无表达的正常卵巢组织（P<0.001，图1）。

2.3 LncRNA PVT1表达与PD-L1表达相关性分析

LncRNA PVT1 表达与PD-L1 表达呈正相关（r=0.629，P<0.001，图2）。

2.4 LncRNA PVT1 和PD-L1 的表达与CREOC 患 者的临床病理特征关系

LncRNA PVT1 和PD-L1 的高表达与组织学分级、FIGO 分期和淋巴结转移有关（P<0.05），LncRNA PVT1 高表达与残留病灶大小、血清CA125 水平有关（P<0.05，表2）。

表1 139例CREOC患者的临床病理特征

2.5 CREOC患者的生存预后分析

采用Kaplan-Meier 法进行单因素分析显示，CREOC 患者的PFS 和OS 与淋巴结转移、FIGO 分期、组织学分级、残留病灶大小、LncRNA PVT1和PD-L1表达相关（均P<0.05，表3）。采用Cox 比例风险回归模型进行多因素生存分析显示，淋巴结转移是PFS和OS的独立风险因素（P<0.05，表4）。

根据qRT-PCR 检测结果计算LncRNA PVT1 表达的中位数，同时根据免疫组织化学法检测评分标准评定PD-L1 表达，结果显示LncRNA PVT1 和PDL1 的高表达患者的PFS 和OS 明显低于LncRNA PVT1和PD-L1的低表达者（P<0.05，图3，4）。

图1 免疫组织化学法检测的不同病理类型CREOC患者的PD-L1表达（IHC×400）

图2 CREOC组织中的LncRNA PVT1表达与PD-L1表达相关性分析

表2 CREOC患者中LncRNA PVT1和PD-L1的表达与临床病理特征的关系

表2 CREOC患者中LncRNA PVT1和PD-L1的表达与临床病理特征的关系（续表2）

表3 影响139例CREOC患者的单因素生存分析

表3 影响139例CREOC患者的单因素生存分析（续表3）

表4 影响CREOC患者的多因素生存分析

图3 CREOC患者的PFS分析

图4 CREOC患者的OS分析

3 讨论

研究表明，非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）包括miRNA、siRNA、piRNA和LncRNA，作为基因表达的重要调控因子在卵巢癌发生转移和化疗耐药方面起着重要作用［6］。其中LncRNA已被证实参与细胞调节迁移、增殖和凋亡等多种过程［7-9］，与卵巢癌的发生发展密切相关［2，10］。另一个备受瞩目的免疫治疗热点是PD-1/PD-L1通路，PD-L1是PD-1的主要配体，表达于包括乳腺癌、胃癌等多种癌细胞表面，而PD-L1在卵巢癌中的作用也较显著，并可加速卵巢癌的进展［3］。

目前，研究表明LncRNA与PD-L1之间存在着紧密联系，如HOTTIP 和EMX2OS可通过上调免疫细胞表面PD-L1的表达，从而抑制免疫应答，加速机体内卵巢癌细胞的免疫逃逸［5，8］。研究显示，包括卵巢癌在内的多种肿瘤中LncRNA PVT1参与免疫检查点的调节，从而促进肿瘤进展［11-12］。本研究证实，CREOC组织中的LncRNA PVT1表达和PD-L1表达均明显高于正常卵巢组织（P<0.05），并且进一步发现LncRNA PVT1表达与FIGO分期、组织学分级、淋巴结转移、残留病灶大小、血清CA125 水平有关（P<0.05），PD-L1表达与FIGO 分期、组织学分级和淋巴结转移有关（P<0.05）。本研究进一步证实发现，LncRNA PVT1表达与PD-L1 表达呈正相关，并且LncRNA PVT1 和PD-L1 高表达患者的PFS 和OS 比LncRNA PVT1 和PD-L1低表达患者低，与以往的研究相一致［11-12］。

综上所述，抑制LncRNA PVT1 与PD-L1 免疫检查点的联合治疗，可能将为提高CREOC 患者的免疫治疗及提高患者生存预后提供一个新的方向。本研究因纳入CREOC 病例数相对较少，且各病理类型所占比例差距较大等问题，而未能对易产生化疗耐药性，如卵巢透明细胞癌、黏液性腺癌等病理类型中的LncRNA PVT1与PD-L1相关性进行进一步研究。今后将扩充样本量，均衡各病理类型，分析CREOC患者不同病理类型的LncRNA PVT1与PD-L1表达的相关性，为卵巢癌的个体化治疗提供潜在的治疗方式。