基于果蝇模式生物刺玫果抗衰老活性及作用机制研究

翟春梅,白晨曦，石雅维,付敬菊,秦蓁,孟永海

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

刺玫果(RosamaximowiczianaRegel)具有健脾理气、养血调经的作用，民间大量采食或用于泡茶、泡酒等，有“维生素记录保持者”之称。刺玫果野生资源丰富、广泛生长在大小兴安岭原始森林之中，无任何污染，营养丰富，具有明显的提高免疫力、改善人体疲劳和壮阳等保健功能，是一种多营养，多功能，多用途的药食同源宝贵资源，而黑龙江省具有得天独厚资源优势且具有广阔的开发前景。

野生刺玫果含有大量黄酮类、三萜类、皂苷等成分[1-5]，富含人体必需的微量元素，号称“生命之花”“Vc之王”，被欧洲各国视为“治疗坏血症特效药”[6]。刺玫果是一种安全无毒的天然资源，研究结果表明刺玫果具有明显的抗衰老、抗疲劳、耐缺氧和类性激素[7-8]，预防心血管系统疾病、提高免疫力[9]，保肝、防癌、促智作用[10]及清除羟自由基及抗DNA损伤及抗辐射等作用。刺玫果可使老龄小鼠MDA含量降低，SOD、GSH含量明显增加，肌、肝糖原含量显著增加等抗衰老作用机制。

为了进一步探讨刺玫果抗氧化抗衰老活性机制以及深入开发其保健功能及相关产品。本文以果蝇为模式生物模型，以果蝇寿命、攀爬能力等寿命相关行为学指标及MDA、SOD、GSH(与抗氧化相关重要指标)和糖原、LDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶(与能量代谢相关重要指标)等为综合考察指标，探讨基于果蝇模式生物的刺玫果抗衰老活性机制。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物

Canton S品系野生型黑腹果蝇(购自上海生命科学院)。

1.2 仪器与试剂

刺玫果(产自东北大兴安岭)；蔗糖(批号:20180103)；丙酸(批号：20170327)；酵母粉(批号：1439447-02)；琼脂(批号：EZ1609C222)；梅特勒分析天平(型号：MS105)；BIOTEK酶标仪(型号：EPOCH 12)；THERMO紫外分光光度计(型号：EVOLUTION 260)；AL 204电子天平(美国METTLER TOLEDO公司)。

1.3 药品的制备

刺玫果醇提物冻干粉的制备：以8倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并回收乙醇后，冻干成粉备用。

1.4 实验分组及给药方法

果蝇培养基采用基础培养基的制备方法：称取蔗糖6.2 g,玉米粉8.4 g琼脂0.6 g,加入蒸馏水92 mL，边加热边搅拌，煮沸至糊状后停止加热，等待温度降至(65±5)℃时，加入0.6 g酵母粉，在吸取0.6 mL丙酸搅拌均匀，立即分装至果蝇指管中。给药培养基的配制方法在普通培养基中添加高(1.845%)、中(0.46%)、低(0.115%)剂量的刺玫果醇提物冻干粉，对照组则给予正常培养基饲养。参照文献方法加以改进[11-13]考察果蝇行为学。

1.5 果蝇抗氧化及能量代谢相关指标的检测方法

果蝇收集与分组同上。在饲养第10日、20日、30日时，果蝇饥饿2 h后液氮速冻，快速移入-80 ℃冰箱中保存，需要时用生理盐水研磨成10%的匀浆组织，按照试剂盒说明书检测MDA、SOD、GSH等氧化相关指标和糖原、LDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶等能量代谢相关指标。各试剂盒均用10%的匀浆组织测试。

1.6 统计学处理

2 实验结果

2.1 刺玫果对果蝇行为学的影响

本研究首先考察了刺玫果醇提物对果蝇寿命及寿命相关行为学的影响，结果表明刺玫果醇提物具有抗衰老作用，可延缓果蝇寿命、改善果蝇寿命相关的行为学指标[1]。

2.2 刺玫果醇提物对不同时期果蝇体内丙二醛(MDA)含量的影响

随着果蝇日龄的逐渐增加，其自身MDA含量呈明显的增加趋势，体内MDA含量与果蝇的衰老程度呈正比，中剂量组10日蝇MDA含量与对照组相比有显著性差异(P<0.05)，高剂量组30日蝇雌果蝇与对照组相比有极显著性差异(P<0.01)。以空白组为例，雌果蝇10日龄MDA含量(1.897 mg/g)到30日含量(2.597 mg/g)MDA增加了0.7 mg，而高剂量组雌果蝇MDA只增加了0.155 mg/g，表明刺玫果醇提物可抵抗果蝇延缓衰老的作用，结果见表1。

2.3 刺玫果醇提物对不同时期果蝇体内超氧化物歧化酶(SOD)含量的影响

随着果蝇日龄的增加，各组果蝇体内SOD含量呈现降低趋势，结果发现，与空白组相比，给药组各个阶段SOD含量减少缓慢，而空白组SOD含量下降趋势明显。与对照组相比，20日龄各剂量组雌果蝇SOD含量呈现显著性(P<0.05或P<0.01)，30日龄高、中剂量组雌果蝇与低剂量组雄果蝇SOD含量呈现显著性(P<0.05)。各组雌雄果蝇无显著性差异。结果见表2。

2.4 刺玫果醇提物对不同时期果蝇体内谷胱甘肽(GSH)含量的影响

随着果蝇日龄的增加，各组果蝇体内GSH含量呈现降低趋势，与空白组相比，给药组各个阶段GSH含量减少缓慢，而空白组GSH含量下降趋势明显。与空白对照组相比，高剂量组20日雌果蝇(P<0.01)和低剂量组20日龄雄果蝇(P<0.01)体内GSH含量均呈现显著性差异，高剂量组30日龄果蝇(P<0.01)与中剂量组30日龄雌果蝇(P<0.01)体内GSH含量呈现显著性差异，结果见表3。

2.5 刺玫果醇提物对不同时期果蝇体内糖原含量的影响

随着果蝇日龄的增加，各组果蝇体内糖原含量呈现降低趋势。与空白组相比，给药组各个阶段糖原含量减少缓慢，而空白组糖原含量下降趋势明显。与空白组相比，高剂量10日龄雌果蝇体内糖原含量呈现显著性差异(P<0.05)，高、低剂量组20日龄雌果蝇糖原含量呈现显著性差异(P<0.05或P<0.01)，高剂量组和中低剂量组雌果蝇30日龄果蝇糖原含量呈现显著性差异(P<0.05或P<0.01)。值得注意的是，各个阶段各个时期的雌果蝇体内糖原含量均高于雄果蝇，糖原含量可能和果蝇的性别差异有关。见表4。

2.6 刺玫果醇提物对不同时期果蝇体内LDH含量的影响

随着果蝇日龄的增加，各组果蝇体内LDA含量呈现降低趋势。与空白组相比，高、中剂量组10日蝇雌果蝇体内LDH含量呈现显著性差异(P<0.05)，高、中剂量组果蝇和低剂量组20日雌果蝇体内LDH含量呈现显著性差异(P<0.05或<0.01)；高剂量组30日蝇和中剂量组30日雄果蝇体内LDH含量呈现显著性差异P<0.05)，且呈现明显的剂量依赖性，见表5。

2.7 刺玫果醇提物对不同时期果蝇体内Na+-K+-ATP酶含量的影响

随着果蝇日龄的增加，各组果蝇体内Na+-K+-ATP酶含量呈现降低趋势。与空白组相比，低剂量组10日龄雌果蝇呈现显著性差异(P<0.05)；高剂量组20日龄雌果蝇体内Na+-K+-ATP酶含量呈现显著性差异(P<0.05)，中剂量组20日雄果蝇和低剂量组20日龄雌果蝇体内Na+-K+-ATP酶含量呈现显著性差异(P<0.05)。高剂量组30日龄果蝇体内Na+-K+-ATP酶含量呈现显著性差异(P<0.05或P<0.01)。见表6。

2.8 刺玫果醇提物对不同时期果蝇体内Ca2+-Mg2+-ATP酶含量的影响

随着果蝇日龄的增加，各组果蝇体内Ca2+-Mg2+-ATP酶含量呈现降低趋势。与空白组相比，各剂量组10日龄雄果蝇呈现极显著性差异(P<0.01)；高剂量组20日龄果蝇体内Ca2+-Mg2+-ATP酶含量呈现显著性差异(P<0.05)；高剂量组30日龄果蝇和中剂量组30日龄雌果蝇体内Ca2+-Mg2+-ATP酶含量呈现显著性差异(P<0.05)。见表7。

3 结语

果蝇寿命调控的生理生化机制结果发现胰岛素/类胰岛素生长因子、保幼激素、TOR信号网络、热量限制和饮食限制、氧化应激、腺苷酸活化蛋白激酶信号通路、鞘脂类代谢及小分子RNA都会对果蝇的寿命产生影响[14]。检测动物的存活寿命是研究老龄化研究最直接的证据。

随着生物年龄的增加，自由基促成的脂质过氧化物也增高[15]，当氧化自由基作用细胞中的脂类物质时，即产生MDA等分解产物。MDA作为机体脂质过氧化反应的最终代谢产物，其高低又间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度[16]。存在于生物体内的抗氧化酶系SOD，可有效地清除细胞代谢过程中产生的氧自由基[17]，GSH是生物体内氧自由基消除系统的重要防线，主要起对细胞膜结构和功能的保护作用[18]。研究发现刺玫果醇提物对30日龄果蝇体内MDA含量有显著性作用，虽对中、低剂量组MDA含量无显著差异，但是有降低趋势；刺玫果醇提物对各剂量组20日龄和30日龄果蝇体内SOD、GSH含量均有不同程度的提高，这些充分说明刺玫果抗衰老的机制可能是清除自由基延缓衰老。

人体最重要的供能物质是糖类，维持机体活动需要的基本能量，糖类不但能参与细胞的多种活动而且是构成机体的重要原料。肝糖原储备充足时，可供给机体足够的糖分来减少其他供能物质如蛋白质的消耗增强抵抗力。本实验对刺玫果醇提物的不同时期体内含糖量做出研究，结果发现随着果蝇日龄的增加，果蝇体内糖原含量呈现降低趋势，给药组各个阶段糖原含量减少缓慢，而空白组糖原含量下降趋势明显，刺玫果醇提物的高剂量组10、20、30日龄果蝇糖原含量明显升高，呈现显著性差异(P<0.05)，此实验说明，给予果蝇一定剂量的刺玫果提取物，可能是维持机体有充足供能物质，使不同时期的果蝇保持相对活力的攀爬能力。有趣的是各剂量组各个时期的雌果蝇体内糖原含量均高于雄果蝇，糖原含量可能和果蝇的性别差异有关。

钠钾泵是一种特殊蛋白质，具有ATP酶活性，且镶嵌在细胞膜上，作用是维持细胞内外的水平衡，也维持细胞内外的渗透压平衡和正常的离子分布。Na+-K+-ATP酶位于细胞膜上，是维持细胞内外渗透压平衡和细胞内外K+浓度平衡的重要供能物质[19]，内源性三磷酸腺苷(ATP)是活细胞代谢最重要的能量来源，而乳酸脱氢酶(LDH) 参与细胞的无氧代谢，是最重要的无氧酵解酶之一。刺玫果醇提物对各剂量不同时期果蝇体内Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶、LDH有不同程度的影响，尤以高剂量组效果最好，中剂量组次之，说明刺玫果可喂养果蝇后，可提高果蝇体内的物质代谢和能量代谢。

本实验以果蝇为生物模式对刺玫果提取物的抗衰老作用进行研究，结果显示，不同剂量的刺玫果醇提物均可延长果蝇寿命，且在一定浓度范围内随着浓度的升高，果蝇寿命与剂量呈依赖性[13]。可改善果蝇MDA、SOD、GSH等氧化相关指标和糖原、LDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶等能量代谢相关指标。刺玫果醇提物可延长果蝇寿命，其机制与提高果蝇抗氧化作用和能量代谢密切相关。