基于气孔性状的文冠果种质资源抗旱性评价及抗旱资源筛选

王孟珂 田梦妮 毕泉鑫 刘肖娟 于海燕 王利兵

（中国林业科学研究院林业研究所，国家林业局林业培育重点实验室，北京 100091）

文冠果（Xanthoceras sorbifoliumBunge）无患子科（Sapindaceae）文冠果属（Xanthoceras），灌木或小乔木，奇数羽状复叶。主要分布在我国北部，西至新疆、宁夏，北至内蒙，南至河南［1］。文冠果是我国特有的木本油料作物，种子含油率较高，高达66.39%，脂肪酸组成良好，可作为理想的食用和工业用油树种，国家林业局已将其列为生物质柴油原料基地建设的主要树种［2～3］。然而，在我国文冠果主要分布的“三北”地区降雨量匮乏，干旱胁迫已是影响文冠果生长、品质以及产量的最为重要的因素之一［4］。

在非生物胁迫中，干旱胁迫对植物的危害较大，其中气孔调节是抵御干旱胁迫和适应环境的机制之一［5］，植物体与外界进行气体和水分交换都是通过气孔来实现，气孔的大小、密度和导度对干旱条件都有着适应性分化，因此气孔特征在一定意义上可以作为抗旱性评价标准［6～7］。有研究表明，通过植物对干旱环境的不同响应，评价其抗旱性，在现有的种质资源中筛选出抗旱的优良种质，是一种可以实施的方法［8～9］。通常采用主成分分析、隶属函数值和聚类分析等方法对气孔性状进行评价，从而评估植物的抗旱性［10～11］。

文冠果分布较广，种质资源丰富，不同的种质资源的耐旱性差异明显，但是目前我国对文冠果资源的抗旱评价较少，本研究是课题组在对我国文冠果资源全面调查分析的基础上［4］，收集108 份文冠果种质资源，观测气孔的12项指标，综合采用隶属函数值法、聚类分析法和主成分分析法对文冠果种质资源进行抗旱性筛选与评价，筛选出抗旱的种质资源，可以为文冠果抗旱机制、相关基因挖掘等研究提供理想的材料，同时为抗旱育种、大规模栽培以及产业发展提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验地内蒙古自治区鄂尔多斯市鄂托克前旗的文冠果良种繁育基地（107°29'，38°11），属中温带温暖型干旱、半干旱大陆性气候。2017 年7 月，选取天气晴朗的上午，对108 株长势良好的8 年生实生文冠果的叶片进行采样。于每株树的正南方向选取无病害且长势良好的成熟复叶片3～5 片，取中间小叶片20 片，放入FAA 固定液（70%酒精90 mL+冰醋酸5 mL+福尔马林5 mL）中储存。

1.2 试验方法

用离析液使叶片解离。将FAA 固定液中的叶片取出，经50%、70%、85%、95%浓度的乙醇梯度分别脱水15 min，在每个叶片的左端、右端、底端和尖端各取0.5 cm×0.5 cm 大小的4 个正方形叶片置于试管中，并用蒸馏水冲洗，沸水浴7～8 min 后取出，待温度冷却至室温后，用解离液（冰醋酸∶30%双氧水=1∶1）将试管中的蒸馏水替换，换液后置于60℃烘箱7～9 h，待到叶片变为白色半透明状后用蒸馏水冲洗，毛笔刷除叶肉部分，剩余叶片的下表皮用番红—固绿染色［12］。

1.3 测定项目与方法

使用Motic DigiLabll 显微数码影像系统拍照观察，Motic Iamges Plus 2.0 测量气孔长度（SL），包括气孔孔隙长轴长度（LAS）、气孔孔隙短轴长度（SAS）、气孔宽度（SW）、气孔面积（SA）、气孔周长（SC）、气孔开口面积（ASO）、气孔开口周长（CSO）、叶片面积（S）以及单位面积气孔数量（Q），测量20个视野。根据上述指标计算气孔密度（SD）、气孔总面积占叶片面积比例（SP）、气孔开口面积指数（SOI）和气孔面积指数（SAI）。SOI 指理论上叶片气孔的最大开口面积与叶片面积的比值。其中：

1.4 数据处理与分析

运用Microsoft Excel、Rstudio与SPSS 19.0软件进行数据处理，根据108株文冠果的叶片的气孔特征进行系统聚类、方差分析及主成分分析，采用Tamhane’s T2（M）法进行多重比较，运用隶属函数分析法对文冠果抗旱性进行综合评价［13］，隶属函数值越大，抗旱性就越强；反之，抗旱性就越弱。计算隶属函数值的公式如下：

式中：Ypq为第p组的第q个指标的抗旱隶属函数值；λpq为第p组的第q个指标测定值；λqmax为第q个指标的最大值；λqmin为第q个指标的最小值；Yˉp为第p组植物的抗旱隶属均值；n为所测指标数。

2 结果与分析

2.1 干旱环境对文冠果叶片气孔的影响

对文冠果叶片气孔各性状进行统计分析表明气孔特征、气孔面积占叶面积比例和气孔面积指数等性状变幅不同（见表1），变异系数在10.12%～836.93%，说明供试材料的108 份文冠果种质资源存在明显差异。其中气孔开口面积指数在各材料之间存在较明显的差异，变异系数为836.93%，气孔长相比于其他性状在各材料中的变异系数较低为10.12%。对叶片气孔各性状进行方差分析，108份文冠果种质资源各性状均存在极显著差异（P＜0.01），即文冠果不同种质资源叶片气孔的各性状对干旱环境均有不同程度的响应。

表1 108份文冠果叶片气孔12个性状变化统计Table 1 Statistics of 12 characters of stomata in 108 X.sorbifolium

2.2 气孔的相关性分析

对108 份文冠果气孔各性状进行相关性分析（见表2），可以看出大多数性状间存在显著（P＜0.05）或极显著相关（P＜0.01）。其中气孔面积与气孔长、气孔空隙长轴长、气孔宽、气孔周长、气孔开口周长、气孔面积占叶面积比例、气孔面积指数和气孔开口面积指数存在极显著相关。气孔空隙短轴长和气孔开口面积与气孔密度成负相关（R=-0.496、R=-0.443）。说明在干旱环境中，叶片气孔的各性状间大多数存在相关性，但单个的抗旱性状不能有效的评价文冠果种质资源的抗旱性，应对多种性状全面的准确评价干旱下文冠果的特性。

表2 干旱地区108份文冠果种植资源叶片气孔特征12个性状之间的相关性分析Table 2 Analysis of the correlation between 12 traits of stomata in 108 X.sorbifolium in arid area

2.3 抗旱性状的主成分分析

为筛选适合在干旱地区种植的文冠果种质资源，将气孔的12项指标进行主成分分析，包括气孔长度、气孔空隙长轴长度、气孔宽度、气孔空隙短轴长度、单个气孔周长、单个气孔面积、单个气孔开口面积、气孔密度、气孔面积占叶面积比例、气孔面积指数和气孔开口面积指数。分析结果见表3，其中特征值大于1 的主成分共3 个，累计贡献率高达93.408%，说明这3 个主成分能够反映文冠果气孔特征的绝大部分信息。其中第Ⅰ主成分累计贡献率为70.586%，为主要综合因子，除气孔空隙短轴长度与其相关性较弱外，其他变量均与其密切相关且为正相关，其中单个气孔面积和气孔密度的特征值较高。第Ⅱ主成分中气孔开口面积指数特征值较高，第Ⅲ主成分中气孔面积指数特征值较高。气孔小且密度大有利于减少水分蒸发同时满足自身所需的生理反应。

表3 文冠果气孔结构指标主成分荷载矩阵Table 3 principal component load matrix of stomatal structure index of X.sorbifolium

2.4 抗旱性聚类分析及种质资源筛选

根据气孔长度、气孔空隙长轴长度、气孔宽度、气孔空隙短轴长度、气孔周长、气孔面积、气孔开口面积、气孔开口周长、气孔密度、气孔面积占叶面积比例、气孔面积指数和气孔开口面积指数对108份种质资源用离差平方和法进行聚类分析，结果见图1。当欧式距离为5 时，108 份种质资源可分为三个类群，并对三个类群采用隶属函数值进行抗旱性分析，第一个类群为抗旱节水型，综合评价值为0.9，占供试材料的29%；第二个类群为中间型，抗旱性居中，综合评价值0.46，占供试材料的45%；第三个类群为敏感性，抗旱性较差，综合评价值0.22，占供试材料的26%。

干旱环境中3 组类型的叶片气孔形态差异明显（见图2），抗旱性较强的A 组气孔形态较小且密度较大，气孔开度较小；抗旱性为中间型的B 组气孔形态较大，气孔密度和气孔开度介于A 组和B组之间；抗旱性较差的C组气孔开度较大。

将聚类分析得到的3 组气孔的各项指标进行方差分析（见表4），气孔长度、气孔空隙长轴长度、气孔宽度、气孔空隙短轴长度、单个气孔周长、单个气孔面积、单个气孔开口面积、气孔密度、气孔面积占叶面积比例、气孔面积指数存在极显著差异（P＜0.01），单个气孔开口周长存在显著差异（P＜0.05），其中气孔长度、气孔宽度、单个气孔周长和单个气孔面积在B 组最高分别为51.12 μm、39.65 μm、294.87 μm、1 605.43 μm2，在A 组中最低分别为47.08 μm、27.75 μm、251.57 μm、1 044.12 μm2；气孔空隙长轴长度、气孔空隙短轴长度、单个气孔开口周长和单个气孔开口面积在C 组最高分别为27.37 μm、6.57 μm、124.45 μm、144.87 μm2，A 组最低分别为23.24 μm、3.49 μm、101.07 μm、66.84 μm2；气孔密度在A 组最高为475.39 个·μm-2，C 组最低为238.89 个·μm-2；气孔面积占叶面积比例在B 组最高为60.79%，C 组最低为26.99%；气孔面积指数在A组最高为1.05%，C组最低为0.58%。

表4 3种类型的文冠果气孔的方差分析Table 4 Analysis of variance of three types of X.sorbifolium

对12个指标采用隶属函数值法进行抗旱性分析，隶属函数值越大抗旱性越强，从表5 中可知A组的综合评价值最高为0.902，C 组的综合评价值最低为0.221，因此在这些种质资源中抗旱性为A组＞B 组＞C 组。初步筛选出No.84、No.82、No.92、No.81、No.85、No.4、No.2、No.1、No.86、No.99、No.71、No.95、No.96、No.76、No.75、No.28、No.87、No.106、No.100、No.107、No.97、No.104、No.98、No.105、No.101、No.108、No.102、No.78、No.25、No.73和No.103，共31份种质资源适宜栽种在较为干旱的地区，为抗旱种质资源。

表5 文冠果气孔结构指标的抗旱性评价Table 5 drought resistance evaluation of stomatal structure index of X.sorbifolium

3 讨论

气孔是高等植物与外界进行CO2和水气传输的主要通道和调节器官，调节着植物的碳同化和水分散失的平衡关系［14］。气孔调节是抵御干旱和适应环境的主要机制之一［15］，在干旱环境中，气孔会较早关闭来减少叶片中水分的散失［16］。高光合效率的植物一般气孔小而多，密度大，灵活性高，这些特征可使叶片减少水分散失，从而保持充足的水分供应来提高光合效率，植物的光合效率越高，表明植物的抗旱性越强［17］。气孔面积指数决定气孔导度的变化，一般气孔导度随水势的下降而减小［18］，从达到减少水分散失的目的，气孔面积占叶面积比例和气孔面积指数均与叶片的气孔导度呈显著的线性正相关关系，较高的气孔开口面积指数有利于植物保持体内与外部环境的水分平衡［19～23］，有研究表明轻度干旱会使细胞受抑制，叶面积减少［14］，气孔密度增加，在重度干旱下叶片受影响严重，气孔数目减少从而增加气孔密度［24～26］。本研究表明，文冠果在适应干旱环境下会降低气孔长度和宽度，从表1中可知抗旱性强的A 组类型的文冠果气孔长度和气孔宽度在三组中最小，但气孔密度最高。干旱敏感型的C 组的气孔面积指数、气孔密度在三组中最低，C 组的种质资源在干旱地区的失水率可能较高，适应干旱能力较差。在干旱环境中A 组的调节能力要比C 组强。该结果与砂生槐（Sophora moorcroftiana）、赤皮青冈（Cyclobalanopsis gilva）幼苗、德国补血草（Linminoium tataricum）和番茄（Lycopersicon escul‐entum）等［27～30］相似。

近年来，对逆境下植物的生长机制的相关研究越来越多，如低温胁迫、盐胁迫、重金属胁迫等，但最为常见的是干旱胁迫［31］，干旱作为植物生长过程中的主要制约因素之一，会阻碍植物的呼吸作用、光合作用和气孔运动等，进而影响植物的生长发育和生理代谢［32］。植物对干旱胁迫下的响应，表现在多个性状中，如主根的长短、叶片的厚度及气孔的导度等，有研究学者表明单一性状无法准确对植物的抗旱性做出准确评价［33］。采用主成分分析法确定各指标的权重，用隶属函数法对筛选出来的指标进行抗旱性评价。

本研究的主要目的是评估文冠果叶片气孔特征可否作为评价抗旱性的依据。结果表明本研究方法可以充分了解气孔性状在干旱环境下对文冠果生长的影响，明确文冠果不同种质资源之间的抗旱性差异。对来自干旱和半干旱地区的108 份文冠果种质资源材料进行研究，测定的叶片气孔的12个性状指标均发生了不同程度的变化。用主成分分析法进一步进行分析，得到了3 个主成分，特征向量载荷最大的是气孔密度、气孔开口面积指数和气孔面积指数。通过主成分分析法和隶属函数值法相结合的方法，将多个性状简单化，较详细的反映文冠果种质资源的抗旱性信息，确定气孔面积可作为抗旱鉴定的主要指标，同时筛选出31份抗旱文冠果种质资源材料。