越冬期红叶石楠和桂花防御低温强光伤害的光保护机制

胡文海 肖宜安 闫小红 叶子飘 曾建军 李晓红

（1. 井冈山大学生命科学学院，吉安 343009；2. 江西省生物多样性与生态工程重点实验室，吉安 343009；3. 井冈山大学数理学院，吉安 343009）

低温和强光是生长于亚热带及其以北地区常绿植物越冬期常遭遇的主要环境因子［1］。叶绿体能量代谢主要涉及原初反应、电子传递和光合磷酸化、碳同化等系列物理和生化反应，对光温极为敏感［2～3］。冬季低温抑制了常绿植物叶片光合酶活性，限制了碳同化的进行，这将导致叶片吸收光能超出碳同化所需，不仅造成叶片光抑制，而且还会诱发细胞内活性氧的产生和积累，并对光合机构产生破坏［4～5］。因此，冬季低温强光环境下常绿植物存在因叶绿体能量代谢失衡而造成光抑制甚至光氧化伤害的潜在风险［6～8］。

常绿植物进化出了系列维持叶绿体能量平衡的越冬光保护策略，主要有以下3 方面：①通过叶片运动和降低叶绿素含量以减少光能的吸收；②上调热耗散、围绕PSⅠ的环式电子传递和光呼吸等能量耗散途径以减少叶绿体内过剩能量积累；③增强细胞内活性氧清除能力以减少活性氧的积累与伤害［9～11］。例如，栽培于美国爱荷华州立大学的高山杜鹃（Rhododendron catawbiense）冬季叶片会通过下垂、卷曲和降低叶绿素含量以减少对光能的吸收，并上调叶片抗氧化酶活性以减轻活性氧积累与伤害［12］；生长于日本温带的常绿植物小叶 青 冈（Quercus myrsinaefolia）、红 楠（Machilus thunbergii）和冷杉属植物（Abies mariesii）在进入冬季后其叶绿素含量和PSⅡ反应中心功能明显下调，而PSⅡ天线色素热耗散能力则在进入冬季低温前就被诱导增强［5，13］。我们的研究也表明，冬季广玉兰阳生叶可通过降低叶绿素含量和捕光色素分子数量以减少对光能的吸收，并且维持较强的光化学和热耗散能力以保护光合机构免受低温强光伤害；阴生叶虽然光化学反应能力相对较弱，但具有较强的热耗散能力，从而有效地保护其免受短时暴露在强光下的伤害［14］。由此可见，不同植物种类和处于不同环境条件下的常绿植物具有不同的越冬策略［15］。

目前，关于常绿植物越冬光保护策略研究主要集中于温带及其以北寒冷地区，由于这些区域的冬季大多会出现长时间零下冰冻，其常绿植物在冬季基本处于休眠状态，主要采取耐冻性或耐冷性越冬策略［6］。而亚热带地区四季分明且冬季以零上低温为主，大多数常绿植物以休眠方式越冬，冬季的零上低温伴随着全光照并不会造成叶片不可逆光抑制伤害。但我们也观察到，一些栽植于亚热带的常绿阔叶植物如红叶石楠（Photinia ×fraseri）进入冬季前或冬季温暖期仍可抽生新枝新叶，存在明显的生长现象。那么亚热带地区冬季生长停滞的常绿阔叶植物和冬季仍有生长现象的常绿阔叶植物在防御冬季低温强光的光保护机制上是否存在差异，其光保护策略又是如何适应其冬季的生长状态？为此，我们采取冬季未见抽生新生枝叶的桂花（Osmanthus fragrans）和冬季有新枝叶抽生的红叶石楠（P.×fraseri）为材料，利用叶绿素荧光技术对越冬期这两种常绿阔叶植物阳生叶和阴生叶的PSⅡ功能与捕光色素分子内禀特性开展研究，以期探索亚热带地区常绿阔叶植物越冬光保护策略的选择及其与生长状态的内在适应性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

实验地点位于江西省吉安市井冈山大学校园内（115°1′18″E，27°6′41″N，海拔80 m）。吉安市属于典型的中亚热带湿润季风区，年平均最低气温为5.2～6.9℃，极端低温为-7.2～10℃［16］。实验于2017年1月进行，试验期间为连续晴天，日最高和最低气温（昼夜）为14℃/4℃。选择校园内生长于全光照环境下、植株高约2.5 m的红叶石楠和桂花作为材料，于上午9：00选择阳生叶和阴生叶各5片，带枝剪下插入水中带回实验室进行叶绿素荧光的测定，12：00时阳生叶叶表光照强度约1 500 μmol·m-2·s-1，阴生叶叶表光照强度约120 μmol·m-2·s-1。

1.2 测定项目和方法

1.2.1 叶绿素荧光参数测定方法

叶绿素荧光参数采用Dual-PAM-100/F（Heinz Walz GmbH，Effeltrich，Germany）进行测定。先进行叶绿素荧光快速光曲线的测定，将叶片暗适应30 min 后，分别测定其最小荧光（Fo）和最大荧光（Fm），然后依次开启11～918 μmol·m-2·s-1的光化光，每个强度的光化光照射叶片10 s后，依据Dual-PAM-100 使用说明书进行叶绿素荧光快速光曲线的测定。然后再进行叶绿素荧光诱导曲线的测定，将叶片再次进行暗适应30 min，测定Fo和Fm后，开 启416 μmol·m-2·s-1的 光 化 光，依 据Dual-PAM-100 使用说明书进行叶绿素荧光诱导曲线的测定，每20 s 记录一次测量参数。光化光由仪器内置的LED 光源提供635 nm 光线，由仪器测定软件直接给出PSⅡ光化学反应所利用的能量（Y（Ⅱ））、PSⅡ调节性能量耗散（Y（NPQ））和非调节性的能量耗散（Y（NO））以及光化学猝灭系数（qP）、非光化学猝灭系数（NPQ）等叶绿素荧光参数，并计算。

PSⅡ最大光化学效率：

PSⅡ潜在光化学效率：

PSⅡ光合电子传递速率：

1.2.2 叶绿素含量的测定

将进行了叶绿素荧光测定的叶片打孔取样，按Arnon［17］的方法，采用丙酮法进行叶绿素含量的测定。

1.2.3 光合生理参数的计算

依据Ye等［18～19］光合电子流对光响应的机理模型，利用模型建立者叶子飘博士提供的光合计算软件（光合计算4.1.1 版本），拟合ETR快速光曲线，计算最大光合电子流（Jmax）和饱和光强（PAR‐sat）。并按Ye等［18～19］的方法计算捕光色素分子总数（N0）、处于激发态的捕光色素分子数（NK）、本征光能吸收截面（σik）、有效光能吸收截面（σ′ik）、处于激发态的捕光色素分子最小平均寿命（τmin）。

1.2.4 实验数据统计

利用SPSS11.5 数据分析软件进行实验数据统计检验。采用t检验分析不同物种内不同处理间的差异性，当P＜0.05 时认为差异显著。采用OriginPro 8.5软件完成作图。

2 结果与分析

2.1 光化学效率、qP和NPQ的比较

越冬期红叶石楠阳生叶和阴生叶的Fv/Fm和Fv/Fo显著高于桂花，且两种常绿植物阴生叶的Fv/Fm和Fv/Fo均高于阳生叶（见图1：A～B）。光化学猝灭系数（qP）随光强的增强而下降，红叶石楠阳生叶和阴生叶的qP没有差异，桂花阴生叶qP则显著低于阳生叶（见图2A）。固定光强下，qP随着光照时间的延长而上升，且两种常绿植物阴生叶qP均低于阳生叶（见图2C）。无论是快速光曲线还是诱导曲线，桂花叶片的qP均明显低于红叶石楠（见图2：A，C）。非光化学猝灭系数（NPQ）则随光强的增强和光照时间的延长而上升，其中红叶石楠阴生叶NPQ显著高于阳生叶，而桂花阴生叶NPQ则低于阳生叶；快速光曲线中桂花阳生叶NPQ显著高于红叶石楠，而光诱导曲线中两种常绿植物阳生叶的NPQ没有显著差异（见图2：B，D）。

2.2 吸收光能分配的比较

在各测量光强下，红叶石楠阳生叶和阴生叶的Y（Ⅱ）均明显高于桂花，但红叶石楠阳生叶和阴生叶间Y（Ⅱ）无明显差异，而在较高光强下桂花阳生叶Y（Ⅱ）高于阴生叶（见图3A）。PSII 调节性能量耗散（Y（NPQ））随着光强的增加而上升，红叶石楠阴生叶Y（NPQ）显著高于阳生叶，而桂花则表现为高光强下阴生叶Y（NPQ）稍低于阳生叶；桂花阳生叶Y（NPQ）明显高于红叶石楠，但桂花阴生叶则在低光强下稍高于红叶石楠，在高光强下则稍低于红叶石楠（见图3C）。低光强下红叶石楠阳生叶Y（NO）稍低于桂花，但红叶石楠阳生叶Y（NO）随着光强增加而上升且明显高于桂花阳生叶；红叶石楠阴生叶Y（NO）未随着光强的增加而增加，且明显低于阳生叶；桂花则相反，阳生叶Y（NO）并未随着光强的上升而变化，但阴生叶Y（NO）则随着光强的上升而增加，且明显高于阳生叶（见图3E）。

光系统Ⅱ光化学反应所利用的能量（Y（Ⅱ））随光照时间的延长而上升，红叶石楠阳生叶和阴生叶的Y（Ⅱ）均明显高于桂花，红叶石楠阳生叶仅在光诱导初期（100 s）稍高于阴生叶，随后则与阴生叶无明显差异；而桂花阳生叶Y（Ⅱ）明显高于阴生叶（见图3B）。光系统Ⅱ调节性能量耗散（Y（NPQ））在诱导初期（60 s）即可受光诱导而迅速上升，且桂花叶片Y（NPQ）高于红叶石楠，但相同树种的阳生叶和阴生叶间无明显差异；然而，随后随着光照时间延长，红叶石楠阴生叶表现出比阳生叶更高的Y（NPQ），而桂花则表现为阳生叶Y（NPQ）明显高于阴生叶，并且桂花阳生叶Y（NPQ）明显高于红叶石楠（见图3D）。光系统PSⅡ非调节性的能量耗散（Y（NO））则表现为随着光照时间的延长而迅速下降，且红叶石楠和桂花阳生叶间的Y（NO）无差异，但光诱导后期红叶石楠阴生叶Y（NO）稍低于阳生叶，而桂花阴生叶Y（NO）则明显高于阳生叶（见图3F）。

2.3 光合电子传递速率的比较

叶片PSⅡ光合电子传递速率的快速光曲线和诱导曲线如图4所示。在各测量光强下，红叶石楠阳生叶和阴生叶的ETR均明显高于桂花，但红叶石楠阳生叶和阴生叶间ETR无明显差异，而在较高光强下桂花阳生叶ETR高于阴生叶（见图4A）。光系统Ⅱ光合电子传递速率（ETR）随光照时间的延长而上升，红叶石楠阳生叶和阴生叶的ETR均明显高于桂花；红叶石楠阳生叶仅在光诱导初期（100 s）稍高于阴生叶，随后则与阴生叶无明显差异，而桂花阳生叶ETR明显高于阴生叶（见图4B）。对ETR快速光曲线的拟合结果表明，红叶石楠阳生叶和阴生叶的Jmax和PARsat均显著高于桂花，且两种树种阳生叶的Jmax和PARsat均高于阴生叶（见表1）。

2.4 捕光色素分子内禀特性的比较

由表1可知：越冬期红叶石楠阳生叶叶绿素含量和N0为阴生叶的1.7倍，而桂花阳生叶则为阴生叶的61.3%，且红叶石楠阳生叶高于桂花阳生叶。本征光能吸收截面（σik）则表现为红叶石楠阳生叶低于阴生叶，而桂花阳生叶则高于阴生叶，但红叶石楠和桂花阳生叶间无明显差异。处于激发态的捕光色素分子最小平均寿命（τmin）则相反，表现为红叶石楠阳生叶高于阴生叶，而桂花则阴生叶高于阳生叶，且红叶石楠显著低于桂花。

表1 越冬期红叶石楠和桂花叶片的叶绿素含量、最大光合电子传递速率(Jmax)、饱和光强(PARsat)和捕光色素分子物理参数Table 1 Chlorophyll content，maximum photosynthetic electron flow（Jmax），maximum irradiance（PARsat）and physicalparameters of light-harvesting pigment molecules in leaves of P.×fraseri and O.fragrans during overwintering

两种常绿植物叶片σ′ik和Nk的快速光曲线如图5 所示。有效光能吸收截面（σ′ik）均随光强的增加而非线性下降，弱光下红叶石楠和桂花阳生叶的σ′ik没有差异，但随着光强的增加桂花阳生叶的σ′ik下降幅度大于红叶石楠，并且在各光照强度下，红叶石楠阴生叶σ′ik均高于阳生叶（见图5A）。处于激发态的捕光色素分子数（NK）则随着光强的增加而非线性增加。红叶石楠和桂花阳生叶的NK没有明显差异，但红叶石楠阴生叶NK低于阳生叶，而桂花阴生叶NK则显著高于阳生叶（见图5B）。

3 讨论

在未受胁迫的情况下，Fv/Fm一般为0.80～0.85［2］，Fv/Fm的降低则表示植物受到光抑制［20］。PSⅡ的潜在光化学效率（Fv/Fo）则与有活性的反应中心数量成正比关系［21］。我们的试验结果表明，越冬期低温胁迫并未引起红叶石楠叶片光抑制，对于桂花而言，也只有在低温强光协同作用下才造成叶片轻微光抑制的发生。并且，无论是全光照还是阴生环境，红叶石楠叶片有活性的反应中心数量均高于桂花，具有比桂花叶片更强的光化学效率（见图1：A～B）。这表明无论是全光照还是阴生环境下，红叶石楠对冬季低温的耐性均高于桂花，且具有更高的光化学效率。

植物可通过减少光能的吸收来防御光抑制的发生。植物叶片对光能的吸收既取决于叶片中叶绿素分子的数量，也取决于捕光色素分子的光能吸收能力［22］。我们的研究表明，红叶石楠阳生叶的叶绿素含量和叶绿素分子数量明显高于其阴生叶，而桂花阳生叶则低于其阴生叶（见表1）。这表明，全光照环境下红叶石楠阳生叶并未通过降低叶绿素含量来减少光能的吸收，而桂花阳生叶则是通过减少叶绿素含量以减少对光能的吸收。捕光色素分子内禀特性决定了光能的吸收与传递［3，23～24］。捕光色素分子的光能吸收截面代表了其对光能的吸收能力，其中本征光能吸收截面（σik）代表了捕光色素分子的潜在光能吸收能力，而有效光能吸收截面（σ'ik）则表示捕光色素分子在不同光强下的实际光能吸收能力［18，25］。红叶石楠阳生叶σik和σ'ik显著低于阴生叶，而桂花则相反，其阳生叶σik和σ'ik均高于阴生叶（见表1，图5A），这说明冬季低温强光降低了红叶石楠阳生叶捕光色素分子的潜在和实际光能吸收能力。由此可见，红叶石楠阳生叶主要通过降低捕光色素分子的光能吸收能力。然而，由于捕光色素分子的σik、σ'ik可以随着温度变化而快速增加，因此有利于温度回升后红叶石楠阳生叶对光能的吸收与转换。同时，我们也观察到红叶石楠和桂花阳生叶的σik并没有差异，但随着光响应曲线光强的增强，红叶石楠阳生叶的σ′ik明显高于桂花阳生叶（见图5A）。这意味着全光照环境下两树种捕光色素分子的潜在光能吸收能力并无差异，但红叶石楠阳生叶捕光色素分子的实际光能吸收能力高于桂花阳生叶。

捕光色素分子吸收光能后从基态跃迁到激发态，如果过多的捕光色素分子处于激发态且不能及时通过光化学反应、热耗散和荧光退激发，将会对植物产生光抑制伤害［10，26］。本实验结果表明，各测量光强下红叶石楠阳生叶处于最低激发态的捕光色素分子数（NK）显著高于阴生叶，桂花阳生叶NK则显著低于阴生叶（见图5B）。并且红叶石楠阳生叶处于激发态的捕光色素分子最小平均寿命（τmin）高于阴生叶，而桂花阳生叶τmin则显著低于阴生叶，但红叶石楠阳生叶和阴生叶的τmin均显著高于桂花（见表1）。这意味着相对桂花阳生叶而言，红叶石楠阳生叶捕光色素分子吸收光能后能够快速转换，并将激发能传递给光系统并通过光化学反应等途径退激发，从而有利于减轻强光对叶片光抑制伤害的风险。事实上，通过比较红叶石楠和桂花Y（Ⅱ）、qP和ETR快速光曲线和诱导曲线，以及Jmax和PARsat也可得出类似结论。红叶石楠阳生叶的Y（Ⅱ）、qP和ETR显著高于桂花（见图2A，C；图3A～B；图4A～B），说明低温强光下红叶石楠保持了较高的光化学能力和光合电子传递速率。而Jmax和PARsat分别代表了叶片潜在的最大光合电子传递速率和饱和光强［18］。桂花阳生叶的Jmax和PARsat均显著低于红叶石楠（见表1），也表明桂花叶片对强光的利用能力显著低于红叶石楠。这可能是冬季的红叶石楠仍保持有较强的光合作用和生长能力的原因。

叶片热耗散能力的增强是植物防御光抑制的另一个重要途径，NPQ反映了PSⅡ天线色素吸收光能通过热的形式耗散［27-30］。我们的研究结果表明，无论是NPQ快速光曲线还是诱导曲线，红叶石楠阳生叶NPQ均显著低于阴生叶，而桂花则相反，其阳生叶NPQ显著高于阴生叶（见图2B，D），两树种Y（NPQ）快速光曲线和诱导曲线也表现出相同的趋势（见图3C，D）。这表明桂花阳生叶主要是通过热耗散能力的增强来防御冬季，而热耗散途径可能并不是红叶石楠防御冬季低温强光的最优光保护策略。

综上所述：红叶石楠和桂花均能够适应亚热带地区冬季低温强光环境，但两树种采取了不同的光保护策略。全光照环境下，红叶石楠主要是通过降低捕光色素分子的实际光能吸收能力以减少光能的吸收，并维持相对较高的光化学能力和电子传递速率，从而保护光合机构免受低温强光伤害；但红叶石楠阳生叶保持了相对较高的叶绿素含量和光化学效率，这有利于温度回升后红叶石楠阳生叶快速转换到以光化学反应为主并促进光合碳同化的进行。而桂花则主要采用减少叶绿素含量，以及增强热耗散能力等逆转速度相对较慢的保护策略为主。这也可能是亚热带地区红叶石楠冬季仍保持生长，而桂花停滞生长的主要原因。