高声压脉冲超声空化作用对兔肝细胞水通道蛋白4及钠钾ATP酶表达的影响

皋月娟 王 菲 董小小 高文宏

肝脏是血管丰富且质脆易碎的腹腔实质性脏器，严重的肝脏损伤引起的失血性休克致死率高达4.0%～11.7%。有效控制损伤肝脏的出血可降低手术治疗的难度，为临床医师和患者提供更好的治疗条件。本课题组前期研究［1-2］发现，在高声压超声辐照的同时辅以血池内脂质微泡灌注，可引起肝细胞急性水肿，继发的肝窦闭塞可显著降低甚至暂时性阻断肝脏局部的血流灌注，使出血量及出血速率显著下降。上述高声压脉冲超声辐照联合血管内微泡引起的超声空化效应致肝细胞水肿的病理改变明确，但其与肝细胞水肿相关蛋白之间的关系尚不明确。国内外超声治疗研究［3-4］证实，低能量超声治疗可引起兔关节软骨及滑膜上水通道蛋白（AQP）表达的降低、抑制兔骨骼肌ATP酶的活性。但上述研究均未采用微泡增强超声作用，关于微泡增强的超声空化作用对肝脏水分子转运相关蛋白表达的影响，目前尚未见相关研究。本实验以此为基础，采用高声压脉冲超声联合血管内微泡注射对兔肝脏组织进行超声辐照后，检测兔肿胀肝脏组织中AQP 4及钠钾ATP酶（Na+-K+ATPase）表达量的变化，探索其与超声辐照时间之间的关系，从而进一步了解超声空化效应对肝脏组织水肿影响的作用机制。

材料与方法

一、实验动物及分组

健康新西兰大白兔41只，由陆军军医大学第二附属医院动物实验中心提供［许可证号：SYXK（渝）2017-0010］，雌雄不限，体质量2～3 kg，3个月龄。将其随机分为空白对照组（n=5）及不同辐照时间组：T1组（辐照时间1 min，n=12）、T5组（辐照时间5 min，n=12）及T10组（辐照时间10 min，n=12）。本实验经陆军军医大学第二附属医院实验动物伦理委员会批准。

二、仪器与试剂

1.主要仪器：使用CZ 960定制型脉冲式超声发射仪（深圳市威尔德医疗电子有限责任公司），由主机、连接电缆及声波发射探头组成，发射脉冲式超声波。

2.主要试剂：盐酸塞拉嗪注射液（陆眠宁Ⅱ，吉林省华牧动物保健品有限公司），2%戊巴比妥钠（美国Sigma公司，P3761），兔抗AQP4多克隆抗体（ab156924）、鼠抗N+-K+ATPase单克隆抗体（ab7671）及辣根过氧化物酶标 记 二 抗（ab205718、ab205719）均由美国Abcam公司生产，“脂氟显”脂质包膜微泡（陆军军医大学第二附属医院超声科自制）。

三、实验方法

1.辐照前准备：将健康新西兰大白兔称重后采用复合麻醉方法麻醉。肌注盐酸塞拉嗪注射液0.3 ml/kg，待动物肌肉松弛后，经耳缘静脉建立静脉通道，静脉注射2%戊巴比妥钠溶液约0.4 ml/kg，待动物角膜反射基本消失后，将其仰卧位固定于动物手术台。腹部备皮，上至胸骨柄水平，下至剑突下10 cm处，两侧至腋前线处。局部皮肤以医用碘伏溶液消毒，铺一次性无菌手术巾。于剑突下沿腹中线逐层切开皮肤及腹壁肌肉宽约4 cm。将肝叶由腹壁切口轻轻拖出，置于腹壁上。

2.超声辐照：选取暴露良好肝叶，将脉冲式超声发射仪治疗头置于肝叶表面，探头与肝叶间置充足无菌耦合剂并排出空气以保证良好耦合。经耳缘静脉通道缓慢推注稀释的脂质微泡（0.2 ml/kg微泡以无菌生理盐水稀释至3 ml），同时按照分组分别辐照肝脏1 min、5 min、10 min。脉冲超声参数设置为：工作波形采用正弦波，探头频率1.07 MHz，脉冲重复频率100 Hz，有效脉冲宽度50μs，峰值负压2 MPa，工作/间歇时间6 s/6 s。治疗结束后取适量肝叶组织于-80°冰箱保存。空白对照组动物仅采用相同方法麻醉后，开腹取适量肝叶组织于-80°冰箱保存。

3.免疫组织化学法观察AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表达：取待检测肝组织，抗原修复后加入3%过氧化氢溶液避光孵育20 min，磷酸盐缓冲溶液（PBS）漂洗后加入3%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭30 min，先后加入一抗及二抗，PBS漂洗，DAB显色液显色，复染、脱水封片。低倍（×100）及高倍（×400）显微镜下观察AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表达分布情况，以细胞膜和/或胞质出现棕黄色颗粒为阳性。

4.蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表达量：取-80°保存待检测肝组织，研磨后加入匀浆液提取总蛋白，蛋白质定量法进行蛋白浓度测定，蛋白上样量为10μg，行十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转至PVDF膜，加入含5%BSA封闭液，室温摇床摇动封闭1 h，加入一抗4℃过夜，抗体稀释液洗膜3次，每次10 min，二抗室温作用1 h，抗体稀释液再次洗膜后，曝光及扫描。以GAPDH为参照，定量计算各组AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表达量。

四、统计学处理

结 果

一、超声辐照后各组兔肝脏AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白分布

超声辐照后，T1、T5、T10组肝细胞出现不同程度肿胀，表现为肝窦间隙变窄、消失，AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表达量均较空白对照组增加，表现为小叶边缘及汇管区强阳性表达细胞数量增多、分布范围广泛。见图1，2。

图1超声辐照后各组兔肝脏组织中AQP 4蛋白（箭头示）表达情况（免疫组织化学染色，×400）

图2超声辐照后各组兔肝脏组织中Na+-K+ATPase蛋白（箭头示）表达情况（免疫组织化学染色，×100）

二、超声辐照后各组兔肝脏AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表达量比较

超声辐照后，T1、T5、T10组AQP 4蛋白表达量均明显高于空白对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），且T1、T10组AQP 4蛋白表达量与T5组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），T1组与T10组比较差异无统计学意义；T5组和T10组Na+-K+ATPase蛋白表达量明显高于空白对照组和T1组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），T5组与T10组比较差异有统计学意义（P＜0.05），T1组与空白对照组比较差异无统计学意义。见表1和图3。

表1超声辐照后各组兔肝脏AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表达量比较（±s）

表1超声辐照后各组兔肝脏AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表达量比较（±s）

与空白对照组比较，*P＜0.05；与T1组比较，#P＜0.05；与T5组比较，△P＜0.05。AQP 4：水通道蛋白4；Na+-K+ATPase：钠钾ATP酶；GAPDH：内参

组别空白对照组T1组T5组T10组F值P AQP 4/GAPDH 0.20±0.01 0.26±0.03*0.34±0.04*#0.27±0.05*△13.751＜0.05 Na+-K+ATPase/GAPDH 0.23±0.03 0.26±0.04 0.34±0.05*#0.30±0.03*#△9.425＜0.05

图3 Western Blot检测超声辐照后各组兔肝脏AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表达量

讨 论

空化效应是超声的主要生物学效应之一，指液体中的微气泡在声压作用下产生的周期性震荡、膨胀甚至内爆的过程［5］。当体内含有大量外源性空化核（如微泡造影剂）时，空化的阈值降低、强度增加［6］。微泡增强超声空化效应已引起国内外研究者的广泛关注，目前相关研究方向包括超声空化溶栓［7］、止血［8］、肿瘤物理疗法［9］、基因转染［10］等。Zhao等［2］研究证实，高声压脉冲超声辐照联合血管内脂质微泡注射可产生血流阻断效应，引起辐照区域肝细胞急性水肿及继发性肝窦闭塞，该效应对肝脏的急性止血效果佳。在此基础上，本课题组前期研究［1］对空化效应致肝细胞肿胀的相关声脉冲参数进行了深入探讨，发现高峰值声压（2 MPa）脉冲超声辐照正常兔肝脏后，辐照区域肝组织肿胀，超声造影显示其血流灌注量下降、血流速度减缓，该处血流下降效应随时间延长逐渐恢复。

值得注意的是，上述实验设置了1min、5min及10min 3个不同时长的超声辐照组，其辐照时间最长相差10倍，然而造影结果却证实，超声辐照时间的长短对血流下降效应无显著影响。考虑到各组间累积声能量有显著差异，因此本实验进一步观察了微观层面上细胞水分子转运相关蛋白的表达情况。

AQP和Na+-K+ATPase均为维持细胞内外水平衡的重要分子。AQP是一组对水有高选择性的细胞跨膜转运蛋白，在细胞膜上形成四聚体，每个单体均包含一个独立的水性孔道［11］，其所介导的自由水快速被动的跨生物膜转运是水进出细胞的主要通道，缺血及细胞内外离子分布的失衡均可上调组织内AQP 4蛋白的表达［12］，从而引起水分子进入细胞内增多，导致细胞水肿。Na+-K+ATPase存在于真核细胞膜上，主要功能为调节钠离子、钾离子的跨膜转运，维持正常情况下细胞内外钠、钾离子的浓度梯度，从而保持细胞内外渗透压的平衡［13］。本实验经免疫组织化学观察及Western Blot检测结果显示，微泡注射联合高声压脉冲超声辐照后，辐照区域肝细胞均表现为不同程度的肿胀，且各超声辐照时间组AQP 4蛋白表达量，以及T5组和T10组Na+-K+ATPase蛋白表达量均较空白对照组显著升高（均P＜0.05），提示高声压脉冲超声空化作用可引起肝细胞水平衡相关蛋白表达量的增加。推测其原因为在高声压脉冲超声辐照下，血池内微泡产生的强烈瞬态空化作用会引起邻近细胞膜的空化损伤，导致声孔形成，引起细胞内外渗透压和离子浓度的失衡，从而上调AQP 4及Na+-K+ATPase的蛋白表达量。

进一步的组间比较结果显示，当辐照时间仅为1 min时（T1组），AQP 4蛋白表达量（0.26±0.03）较空白对照组（0.20±0.01）即已显著升高（P＜0.05）；辐照时间延长为5 min时（T5组），其表达量进一步升高（0.34±0.04），与T1组和空白对照组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而当辐照时间为10 min时（T10组），AQP 4表达量（0.27±0.05）较T5组反而有所降低，与T1组比较差异无统计学意义，其蛋白表达随辐照时间延长呈先升后降的趋势。与AQP 4相似，Na+-K+ATPase蛋白表达量也随辐照时间延长呈先升后降的趋势，在辐照时间为5 min时（T5组）蛋白表达量（0.34±0.05）较对照组显著升高（P＜0.05），辐照10 min时（T10组）其表达量（0.30±0.03）亦有所降低，且与T5组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。表明超声辐照时间的长短对AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表达量的影响不同。结合前期研究［1］结果发现，辐照仅1 min的高声压脉冲超声辐照不仅可引起肝脏组织显著肿胀、血流灌注量下降、血流速度减缓，同时可上调AQP 4的表达。随着辐照时间的延长，肝脏组织血流灌注量变化无显著差异，但AQP4及Na+-K+ATPase蛋白表达量有显著变化，在辐照5 min时（T5组）蛋白表达量较空白对照组及T1、T10组均显著升高（均P＜0.05）。推测可能与肝脏特殊的组织结构有关。声孔效应动力学研究［14］表明，微泡震荡所诱导的声孔效应程度取决于微泡到细胞之间的距离，且当微泡与细胞间距离＜5.5μm时，微泡的数量与声孔效应的程度呈正相关，随着微泡空化数量的增多，声孔效应由可逆转为不可逆。肝脏作为人体重要的代谢器官，为了保证快速充分的物质交换与代谢，肝细胞排列为肝板，每个肝细胞均有两个面紧邻肝血窦的毛细血管，使得进入血液循环的微泡可以与血管内皮细胞及肝细胞紧邻，因此空化效应容易在肝细胞膜上产生声孔，短时间的超声辐照即可引起肝细胞内外的离子失衡，从而引起显著的水平衡相关蛋白表达上调和肝细胞肿胀。然而由于肝细胞排列紧密、组织间质成分少，因此其肿胀程度有限，即使辐照时间延长，其肿胀程度及组织血流灌注量亦无显著差异。然而对于水平衡相关蛋白而言，长时间的组织灌注缺血状态可能导致细胞进一步缺氧，反而使蛋白表达量降低。提示长时间的高声压脉冲超声辐照可能引起组织代偿调节能力的下降。

综上所述，微泡联合高声压脉冲超声辐照可显著上调肝脏组织内两种水分子转运相关蛋白AQP 4和Na+-K+ATPase表达量，且辐照时间对蛋白表达量有影响，辐照1 min即可显著上调水通道蛋白表达量，随着辐照时间的进一步延长，AQP 4及Na+-K+ATPase蛋白表达量呈先升后降的趋势。但本实验未进一步探索上述水平衡相关蛋白表达量与肝脏组织肿胀程度间的关系；此外，未检测肝细胞凋亡相关蛋白的表达，且未进一步阐述辐照时间长短对肝细胞损伤的影响作用。待以后实验研究的进一步完善。