苹果壳色单隔孢溃疡病菌TaqMan实时荧光PCR 检测方法

林惠娇，牟桂萍，滕少娜，张海鹏，周而勋

(1华南农业大学植物保护学院/广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室/农业部华南作物有害生物综合治理重点实验室，广东广州510642；2黄埔海关，广东广州510730；3重庆海关，重庆401147)

苹果壳色单隔孢溃疡病(Diplodiacanker)的病原菌为史蒂芬葡萄座腔菌Botryosphaeria stevensii，异名Physalospora mutila，无性态Diplodia mutila[1-2]，是我国禁止入境的重要检疫性有害生物[3]。其寄主范围非常广泛，可为害苹果Malusspp.、梨Pyrusspp.、李Prunusspp.、葡萄Vitisspp.、栎Quercusspp.、棕榈Trachycarpusspp.等多达11科18属的重要经济植物[4]。根据国际应用生物科学中心(https://www.cabi.org/cpc)公布的相关信息，目前苹果壳色单隔孢溃疡病分布的国家有美国、加拿大、秘鲁、澳大利亚、新西兰、智利、意大利、西班牙、德国、法国、英国、波兰、摩洛哥、匈牙利、葡萄牙、保加利亚、南非、印度等，在我国无分布[5]。该病菌可引起苹果和梨重要的枝干和果实病害，主要导致叶片黄化枯萎，引起枝干溃疡干枯，还可引起果实腐烂，在其他阔叶树上也可引起类似的症状[1,6]。病菌分生孢子在生长季节可通过风雨或昆虫传播[7]，也可随原木、苗木及果实的调运进行远距离传播[8]。该病菌通过贸易进行跨国异地传播的风险极高，一旦传入将对我国水果产业造成很大的威胁。

准确、快速地进行物种鉴定是防止外来有害生物入侵的首要环节。由于葡萄座腔菌属Botryosphaeria真菌的有性态在自然环境和培养条件下都很难产生，而其无性态的形态特征多有重叠且不稳定，因此该属的形态分类鉴定十分困难[9-11]。通过核糖体DNA 序列的分析比较进行种类鉴定已被广泛应用于这一真菌类群[2,12-14]。此外，RAPD[15-16]、ISSR[17-18]、ARDRA[19]、RFLP[20-21]、SSCP[22]、RAMS[23]、MSPPCR 和rep-PCR[24]等DNA 指纹图谱技术也被应用于该类真菌的分类研究。针对葡萄座腔菌属真菌特定类群的特异性检测技术也有相关研究[25-29]。但目前国内外鲜见针对苹果壳色单隔孢溃疡病菌进行实时荧光PCR 特异性检测的报道。

本研究根据苹果壳色单隔孢溃疡病菌的β微管蛋白(β-tubulin)基因保守序列，设计筛选特异引物及探针，旨在建立针对该病菌的实时荧光PCR 检测技术，为口岸的植物检验检疫提供一种灵敏而高效的检测方法。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株包括苹果壳色单隔孢溃疡病菌及其近缘种属、水果上常见的病原菌27株。来源于荷兰微生物菌种保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures,CBS)、中国林业微生物保藏管理中心(China Forestry Culture Collection Center,CFCC)和中国农业微生物菌种保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China,ACCC)等标准菌种库，以及海关从入境货物中分离保存的菌种。供试菌株来源、寄主等相关信息见表1。

1.2 菌丝体培养及DNA 提取

供试菌株接种于PDA 平板于24℃条件下光暗交替培养7～10 d，待菌落长到直径5～6 cm 时，收集菌丝，加液氮研磨后，采用TIANGEN DP320植物基因组DNA 提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取基因组DNA，用Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪(Thermo Fisher Scientific, USA)测定DNA 的浓度和纯度，并于−20 ℃条件下保存。

1.3 引物和探针设计

基于前期获得的苹果壳色单隔孢溃疡病菌及其近缘种的β微管蛋白基因(β-tubulin基因)序列，以Primer Express 3.0(Thermo Fisher Scientific,USA)和Beacon Designer 7.5(Premier Biosoft Company,Canada)软件辅助设计实时荧光PCR 引物和特异性探针，其中，引物BsF1:5′-CGGACGA GACCTTCTGTATTGAC-3′和BsR1：5′-GCTC GAACCAGCCGACTAAG-3′，探针BsP267：FAMCGAGGTACGTGAAATT-MGB。引物及探针委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。并将其输入GenBank 数据库中运用Primer-BLAST 进行序列比对及特异性检验。

1.4 阳性质粒构建

将苹果壳色单隔孢溃疡病菌β-tubulin基因靶标序列片段转入含有氨苄卡那霉素(Ampicillin,Amp)抗性的pUC57载体上，得到苹果壳色单隔孢溃疡病菌β-tubulin基因重组阳性质粒，将目标质粒转入大肠埃希菌Escherichia coliDH5α 后用甘油在−80℃条件下保存。

表1 本研究供试菌株的相关信息Table1 Information of strainsused in thestudy

1.5 特异性测试

以苹果壳色单隔孢溃疡病菌及其近缘种标准菌株的DNA 为模板，进行实时荧光PCR 的特异性检测。PCR 试剂均购自东洋纺(上海)生物科技有限公司(TOYOBO)。PCR 反应体系为20μL，包括10μL 2×Thunderbird Probe qPCR Mix(含1×ROX reference dye)，上、下游引物(10μmol/L)和探针(10 μmol/L)各0.4μL，1μL 模板DNA，加无菌水补至20μL。在ABIStep One Plus实时荧光PCR 仪上设置反应程序为：95℃预变性60 s；95℃15 s，64℃36 s，循环40次。以无菌水为空白对照，以循环阈值CT≤35作为阳性标准阈值。

1.6 灵敏度测试及标准曲线的建立

以带有苹果壳色单隔孢溃疡病菌β-tubulin基因靶标序列的重组阳性质粒pUC-BsBTU 为模板，对TaqMan 探针BsP267进行荧光PCR 灵敏度测试。对质粒DNA 进行系列稀释，得到DNA 质量浓度为100 000、10 000、1 000、100、10、1、0.1 fg/μL 的系列稀释液，各取1μL作为模板进行实时荧光PCR 扩增，反应体系和程序同“1.5”。以无菌水为空白对照，以CT≤35作为阳性标准阈值。以模板量的对数值与所得CT 值建立标准曲线。

2 结果与分析

2.1 阳性质粒的构建

将苹果壳色单隔孢溃疡病菌β-tubulin基因包含BsF1、BsP267和BsR1序列的400 bp片段(图1)插入到pUC57载体上，构建苹果壳色单隔孢溃疡病菌β-tubulin基因重组质粒，该阳性质粒命名为pUC-BsBTU。

2.2 特异性测试

采用引物BsF1/BsR1和探针BsP267对苹果壳色单隔孢溃疡病菌及其近缘种标准菌株以及从水果分离的常见病原真菌进行实时荧光PCR 检测，结果(图2)显示，探针BsP267分别对供试3株苹果壳色单隔孢溃疡病菌目标菌株表现出特异性阳性扩增，荧光信号明显增加，而非目标菌株以及空白对照都没有检测到荧光信号，表现为阴性。结果表明本研究建立的苹果壳色单隔孢溃疡病菌实时荧光PCR 检测方法特异性良好。

图1 靶标基因阳性质粒克隆序列Fig.1 Cloning sequence of positive plasmid of target gene

图2 探针BsP267对苹果壳色单隔孢溃疡病菌的特异性检测Fig.2 Specificity idendification of Botryosphaeria stevensii using probe BsP267

2.3 灵敏度测试

采用探针BsP267对苹果壳色单隔孢溃疡病菌菌株的重组阳性质粒DNA 不同稀释度模板进行实时荧光PCR 检测。结果(图3)显示：质量浓度为100 000、10 000、1 000、100、10、1 fg/μL 的阳性质粒DNA 都能检测到明显的荧光信号，表现为阳性扩增；0.1fg/μL的阳性质粒DNA 的CT值为37.01，超过了35这一阳性标准阈值，这表明BsP267探针对苹果壳色单隔孢溃疡病菌阳性质粒DNA 的检测灵敏度可达到1 fg/μL。

图3 探针BsP267对阳性质粒DNA 的灵敏度检测Fig.3 Sensitivity idendification of positive plasmid DNA using probe BsP267

2.4 标准曲线分析

将苹果壳色单隔孢溃疡病菌菌株的重组阳性质粒DNA，分别稀释至100 000、10 000、1 000、100、10、1、0.1 fg/μL 7个质量浓度梯度后，荧光定量PCR 并构建标准曲线。如图4 所示，CT 值为17.37～37.01，线性回归方程为：y=−3.189lgx+36.692，决定系数(R2)为0.993(参考值＞0.95)，扩增效率为105.858%(参考值范围为90%～110%)，结果表明其线性相关性良好、扩增效率高、满足可信度要求，该方法可应用于苹果壳色单隔孢溃疡病菌的特异性检测。

图4 实时荧光PCR 标准曲线Fig.4 Real-time fluorescent PCR standard curve

3 结论与讨论

开发适用于口岸植物检疫的快速诊断技术，对苹果壳色单隔孢溃疡病菌进行严格检疫，对防止该类病原菌的传入至关重要。前期研究中，对苹果壳色单隔孢溃疡病菌的翻译延长因子基因(EF-1α)、核糖体内转录间隔区基因(ITS)、RNA 聚合酶II第2亚基基因(RPB2)、谷氨酰胺合成酶基因(GS)和核糖体大亚基(LSU)等基因序列进行了特异性引物和探针筛选，最后基于特异性和扩增效率，确定了β-tubulin基因作为苹果壳色单隔孢溃疡病菌特异性检测的靶标基因。β-tubulin基因在细胞生长过程中有着重要作用，其序列具有高度的保守性，具有管家基因的特性[30]。此外，该基因既有保守的外显子又有许多可变的内含子，在不同属、种间蕴含着丰富的变异，常作为标识片段用于真菌的物种鉴定[31-35]。

本研究使用TaqMan MGB探针实时荧光PCR检测壳色单隔孢溃疡病菌。通过大量文献分析及对前期基础研究的总结，选择苹果壳色单隔孢溃疡病菌特异性高、保守性强的β-tubulin基因作为检测靶标。引物BsF1/BsR1和探针BsP267组合对苹果壳色单隔孢溃疡病菌及其近缘种标准菌株以及从水果分离的常见病原真菌的实时荧光PCR 检测结果显示，探针BsP267对供试阳性菌株均表现出特异性扩增，扩增效率为105.858%，最低检测DNA 质量浓度下限为1 fg/μL；而非目标菌株以及空白对照都没有检测到特异性扩增。结果表明本研究建立的苹果壳色单隔孢溃疡病菌实时荧光PCR 检测方法特异性良好，所设计的引物BsF1/BsR1和特异性探针BsP267可对未知样品进行壳色单隔孢溃疡病菌的特异检测。引物和探针的设计在遵循荧光PCR探针设计原则的基础上，将包含更多的种特异性位点作为最重要的考量，同时探针引入了小沟结合物(Minor groove binder,MGB)基团以确保其高特异性。基于TaqMan MGB探针技术的实时荧光PCR方法因为探针序列短，具有分辨率高、稳定性好、背景低、重复性好等优点。实时荧光PCR 比常规PCR(包括巢式PCR 和多重PCR)具有更高的检测灵敏度，其他针对葡萄座腔菌属真菌特定类群的特异性检测研究也印证了这一点[25-29]。

本研究建立了苹果壳色单隔孢溃疡病菌的TaqMan MGB探针实时荧光PCR 检测方法。该方法特异性强、检测灵敏度高，可以提高苹果壳色单隔孢溃疡病菌的检出率和检测速度。既可用于苹果壳色单隔孢溃疡病菌的快速确诊，也可用于进境截获的可疑样品及未知苹果病果样品的快速筛查，在口岸植物检疫中具有很强的可操作性和适用性。该检测方法的建立可以防止苹果检疫性病原真菌的传入和传播，同时也可为进口水果的快速通关提供有效的技术支持。