2株生防细菌协同拮抗马铃薯疮痂病及其防治效果研究

李丽艳 孙杉杉 章孜亮 杨娜 戚家明 杜迎辉

摘要 为筛选出对马铃薯疮痂病具有显著拮抗作用且较强田间防效的生防细菌，采用室内平皿拮抗及田间防效应用试验，检测菌株对马铃薯疮痂病的抑制效果。采用对峙培养试验确定了荧光假单孢菌、解淀粉芽孢杆菌菌体及其发酵菌液对马铃薯疮痂病菌均有明显抑菌效果，抑菌圈直径分别为11、5 mm和15、9 mm;将2种菌株发酵菌液按照1∶1、2∶1复配后，抑菌圈直径分别提高至17、28 mm，说明2种菌液复配对马铃薯疮痂病菌的抑制作用可以起到一定增效效果。通过田间防效试验验证了单一菌肥施用及2种菌肥混合施用对马铃薯疮痂病的防治效果。单一菌肥对马铃薯疮痂病的防效荧光假单孢菌（73.18%）优于解淀粉芽孢杆菌（49.31%），而2种菌肥配施防效显著优于单一菌肥，防效达91.7%。说明荧光假单孢菌及解淀粉芽孢杆菌2种菌肥配施可以有效防治马铃薯疮痂病，在田间应用及推广过程中具有巨大的潜力。

关键词 荧光假单孢菌;解淀粉芽孢杆菌;马铃薯疮痂病;防效

中图分类号 S435.32 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）01-0122-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.01.032

Abstract In order to screen out biocontrol bacteria that have a significant antagonistic effect on potato scab and have a strong field control effect，indoor plate resistance and field control effect tests were used to detect the inhibitory effect of the strain on potato scab. The confrontation culture test was used to determine that Pseudomonas fluorescens，Bacillus amyloliquefaciens and their fermentation broth had obvious antibacterial effects on potato scab bacteria，and the diameters of the inhibition circles were 11，5 mm and 15，9 mm; after the fermentation liquid of the two strains was compounded according to 1∶1 and 2∶1，the diameter of the bacteriostatic circle was increased to 17 and 28 mm，indicating that the combination of the two bacterial liquids could inhibit the potato scab.The effect could play a certain synergistic effect. The control effect of single bacterial fertilizer application and mixed application of two bacterial fertilizers on potato scab was verified through field control efficacy tests. The control effect of single bacterial fertilizer on potato scab （Pseudomonas fluorescens （73.18%） was better than Bacillus amyloliquefaciens （49.31%），and the combined control effect of the two bacterial fertilizers was significantly better than the single bacterial fertilizer，the control effect reached 91.7 %. It showed that the combined application of Pseudomonas fluorescens and Bacillus amyloliquefaciens fertilizer could effectively control potato scab，and it had great potential for application and promotion in the field.

Key words Pseudomonas fluorescens;Bacillus amyloliquefaciens;Potato scab;Control effect

近年來由疮痂链霉菌 （Streptomyces scrabies） 引起的马铃薯疮痂病日益严重，直接影响马铃薯的品质，造成了较大的经济损失。该病病原疮痂链霉菌可在植物病残体或土壤中存活多年，一旦条件适宜就会侵染马铃薯块茎，致马铃薯表面形成凹陷或凸起的疮痂状粗糙硬斑块，严重影响马铃薯的外观品质和经济价值[1-2]。对于该病目前尚缺乏安全有效的防治方法，大多采用化学农药的方法，虽然短期内有一定防治效果，但长期使用不仅污染环境、危害人类健康，还会造成土壤中菌群失调，病害日益加重[3]。生物防治未来将成为马铃薯疮痂病防治的热点和趋势，该方法主要是利用微生物及其代谢产物来抑制病害的发生，是一种环境友好型的病害防治方法。近年来，已有诸多学者筛选出了对马铃薯疮痂病具有防治效果的生防菌株[4-7]，但单一微生物菌剂往往存在功能单一、适应能力差、防效不稳定等问题[8]。将不同功能菌株组合，得到比单一微生物菌剂促生能力更强、更稳定的微生物复合菌剂，是微生物菌剂发展的趋势[9-11]，Siddiqui 等[12]利用荧光假单孢菌（Pseudomonas fluorescens）和根瘤菌（Rhizobium sp.）配制的复合菌剂防治豌豆枯萎病，与单一菌剂相比，豌豆枯萎病发病率显著降低。但迄今未见利用2种生防菌株协同防治马铃薯疮痂病的报道。笔者通过室内拮抗及田间防效试验，旨在筛选出对马铃薯疮痂病菌防效显著的生防菌株，以期为马铃薯疮痂病优良生防菌剂的开发及应用奠定基础。

1 材料與方法

1.1 供试菌株 荧光假单孢菌（Pseudomonas fluorescens）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、病原菌疮痂链霉菌（S.scabies），均为领先生物农业股份有限公司微生物实验室保存菌株。

1.2 拮抗菌株的抑菌能力测定 参考郭凤柳等[7]的纸碟法对拮抗菌株的抑菌能力进行测定，略有改动。将疮痂病菌制成 5×106 CFU/mL的孢子悬液，取 50 μL 均匀涂布于 PDA平板上，挑取一环拮抗菌株涂在已涂布疮痂病菌孢子悬液的PDA 培养基平板上，不接种的平板为对照，30 ℃恒温培养箱中生长4 d 后，观察抑菌圈并测量其直径。

1.3 拮抗菌株发酵菌液及无菌滤液的抑菌活性测定 参考文献[13]的方法制备拮抗菌株发酵液及无菌滤液。挑取一环拮抗菌株接种于 100 mL LB液体培养基中，28 ℃、150 r/min 振荡培养24 h后为发酵菌液。将发酵菌液于高速冷冻离心机上 4 ℃、10 000 r/min离心 10 min，上清用 0.22 μm 细菌滤膜过滤除菌，得到其无菌滤液。采用平板打孔法[14]测定拮抗菌株发酵菌液及无菌滤液对马铃薯疮痂病的抑菌能力，以加入等量无菌水为对照，30 ℃恒温培养 4 d 后，测定抑菌圈直径。

1.4 拮抗菌株及其发酵菌液的解磷能力测定

参考王效禹[15]的方法测定拮抗菌株的解磷能力。挑取一环拮抗菌株涂在蒙金娜无机磷固体培养基上，28 ℃恒温培养箱中培养3～5 d，观察并测量溶磷圈直径;制备拮抗菌发酵菌液，按照5%的接种量转接入蒙金娜无机磷液体培养基上，于28 ℃、180 r/min振荡培养6 d，取5 mL培养液，于12 000 r/min、4 ℃下离心5 min，上清液采用钼锑抗比色法测定解磷量。

1.5 2种菌肥对马铃薯疮痂病的防治效果

试验在河北省昌黎泥井长年种植马铃薯区域开展。对照：空白处理;处理①：荧光假单孢菌发酵菌液75 L/hm2;处理②：37.5 L/hm2解淀粉芽孢杆菌发酵菌液;处理③：荧光假单孢菌发酵菌液75 L/hm2+37.5 L/hm2解淀粉芽孢杆菌发酵菌液，各处理均按照常规种植措施管理。待马铃薯收获后进行马铃薯疮痂病病害分级鉴定，计算病情指数和防治效果[16]。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌对马铃薯疮痂病菌的抑菌活性 分别测定了荧光假单孢菌和解淀粉芽孢杆菌对马铃薯疮痂病菌的抑菌活性。测定结果表明，2株拮抗菌对疮痂病菌均有一定的抑制能力，抑菌圈直径分别为11和5 mm（图1b、c），说明菌株荧光假单孢菌对马铃薯疮痂病菌的室内拮抗效果更好。

2.2 发酵菌液及无菌滤液的抑菌活性

采用平板打孔法测定单一菌株发酵菌液、无菌滤液及复合发酵菌液的抑制效果，结果见图2。由图2可知，2种菌株的发酵菌液对疮痂病菌均有明显的抑菌效果，但无菌滤液没有抑制作用;将2种菌株发酵按照1∶1、1∶2复配后，抑菌圈直径分别由单一菌株的9、15 mm提高至17、28 mm（表1）。说明荧光假单孢菌与解淀粉芽孢杆菌2种发酵菌液复配对马铃薯疮痂病菌的抑制作用可以起到一定增效效果。

2.3 拮抗菌株及其发酵菌液的解磷能力 分别测定了2株拮抗菌株的解磷能力。结果表明，荧光假单孢菌对无机磷有较明显的溶解作用（5 mm），而解淀粉芽孢杆菌未见明显解磷能力;采用钼锑抗比色法测定了荧光假单孢菌的解磷能力，对照有效磷浓度为0.55 mg/L，荧光假单孢菌溶液中有效磷浓度为395.78 mg/L，说明荧光假单孢菌对无机磷具有较强降解能力（图3）。

2.4 2种菌肥对马铃薯疮痂病的防治效果

于8月收获期调查马铃薯疮痂病发病情况。结果表明，单一菌肥施用及2种菌肥混合施用均对马铃薯疮痂病有显著防效，单一菌肥防效处理①优于处理②（表2），而2种菌肥配施处理防效优于单一菌肥处理，防效可达91.7%。说明荧光假单孢菌菌剂及解淀粉芽孢杆菌菌剂2种菌肥配合施用可以有效防治马铃薯疮痂病。

3 结论与讨论

随着植物病害的日趋严重，生物防治已成为国内外学者研究的重点。其中荧光假单孢菌（Pseudomonas fluorescens）及解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）作为非常重要的根际促生菌，在防治植物土传病害、增加作物产量以及防病、定殖机理方面已有诸多报道[17-22]。在防治马铃薯病害方面，蒋继志等[23]从马铃薯根际土壤中筛选出了显著拮抗致病疫霉且离体防病效果显著的荧光假单孢菌M15，菌液在马铃薯块茎切片上对晚疫病的预防效果为65.06%;高同国等[24]筛选得到 1 株对马铃薯疮痂病拮抗活性明显的解淀粉芽孢杆菌12-82。除上述报道外，国内关于利用荧光假单孢菌或解淀粉芽孢杆菌防治马铃薯病害特别是马铃薯疮痂病的研究较少。

该研究利用笔者所在实验室保存菌株筛选出了对马铃薯疮痂病具有显著拮抗作用且较强田间防效的生防细菌荧光假单孢菌、解淀粉芽孢杆菌，2种菌株发酵菌液按照1∶1、2∶1复配后，抑菌圈直径分别由单一菌株15、9 mm提高至17、28 mm;田间防效试验表明单一菌肥对马铃薯疮痂病的防效荧光假单孢菌（73.18%）优于解淀粉芽孢杆菌（49.31%），2种菌肥配施防效显著优于单一菌肥（防效91.7%）。说明荧光假单孢菌及解淀粉芽孢杆菌2种菌肥配施可以有效防治马铃薯疮痂病，在田间应用及推广过程中具有巨大的应用潜力。

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