海藻酸钠微胶囊制备及其在微生物包埋中的应用

项郑昊， 周化岚， 张建国

上海理工大学 医疗器械与食品学院 食品科学与工程研究所， 上海 200093

微胶囊(microcapsules)是应用天然或人工合成的高分子成膜壁材，将固态、液态或气态的物质作为芯材，包裹成具有半通透性或密封的球形微粒。微胶囊作为微型容器具有保护芯材的作用。微胶囊的制备工艺流程影响微胶囊粒径尺寸。微胶囊粒径一般在1 μm ～ 1 000 μm范围内。通常情况下，微胶囊呈固态球形结构，微胶囊具有隔绝外界不良环境(过高的pH、温度、酶)，改变芯材的内在性质(屏蔽气味、毒性、颜色)，控制芯材的释放时间等作用。现今微胶囊已广泛应用于生物医药、化工、食品、农业等领域。海藻酸钠(sodium alginate, SA)是由β-D-甘露糖醛酸(M单元)与α-L-古洛糖醛酸(G单元)通过β-1,4-糖苷键连接，形成不同比例的GM、MM和GG片段组成的多糖[1]。海藻酸钠由于其优良的稳定性、溶解性、粘性和安全性以及生物相容性，是良好的微胶囊外壳组成物质，而且海藻酸钠储量丰富、可再生，海藻酸钠制备的微胶囊被广泛应用。近年来，海藻酸钠微胶囊的制备十分受关注，主要体现在微胶囊直径的控制，保护芯材性质、微生物包埋等方面。海藻酸钠微胶囊的制备方法主要有挤压法、喷雾干燥法、乳化凝胶法、层层组装法，其影响因素主要有海藻酸钠分子量和浓度、辅助材料种类和浓度、交联时间、操作因素等。本文对海藻酸微胶囊的制备及其在微生物包埋的进展进行总结和展望。

1 海藻酸钠微胶囊制备方法

海藻酸钠微胶囊制备方法分为物理法、化学法和物理化学法三类。物理法通过物理、机械作用将壁材包覆在小分子芯材上，例如空气悬浮法[2]、溶剂挥发法[3]、喷雾干燥法[4]等。化学法指化合物单体通过聚合反应形成聚合物外壳，再将芯材包覆，例如挤压法、界面缩聚法[5]、原位聚合法[6]等。物理化学法通过添加溶剂(无机盐、非电解质)或调节 pH，改变温度等措施调节聚合物溶解度，使聚合物从溶液中析出并沉积在芯材表面，形成微胶囊，例如相分离法[7, 8]、层层组装法[9]等。目前制备海藻酸钠微胶囊的常用方法有喷雾干燥法、挤压法、乳化凝胶法、层层组装法。

1.1 喷雾干燥法

喷雾干燥法是将芯材和壁材混合溶液以液滴状态喷到热空气中，水分蒸发而得到球状粉末的过程。喷雾干燥法操作也较简单、成本低、应用广泛。喷雾干燥法制备微胶囊直径取决于喷嘴类型、进料速率、空气流速、入口温度、吸气速率和材料性能等诸多参数[10, 11]。许多研究人员利用喷雾干燥法将微生物[12]、药物[11]、油脂[13]等包覆在海藻酸钠微胶囊中。相比挤压法制备的微胶囊，喷雾干燥法制备的微胶囊的直径较小。MLADENOVSKA等采用壳聚糖-钙-海藻酸钠作为壁材制备成直径小于10 μm的5-氨基水杨酸微胶囊[14]。Na等利用聚乙烯醇制备成直径低至3.1 μm的水/油/水(W/O/W)微胶囊[8]。BOWEY等采用海藻酸钠为壁材，使用喷雾干燥法制备了直径为2.1 μm的包裹胰岛素的微胶囊[15]。SZEKALSKA等使用喷雾干燥法制备了包裹盐酸二甲双胍的海藻酸钠微胶囊，微胶囊的直径范围在1.6 μm ～ 5.7 μm之间[10]。喷雾干燥法制备微胶囊还有利于提高被包裹微生物的活细胞比例。SURYABHAN等使用微胶囊技术包埋酿酒酵母、西方伊萨酵母，使得喷雾干燥法后酵母菌的存活率显著提高，而且酵母微胶囊在模拟胃和胆汁中活细胞比例分别提高32%～64%和46%～80%[16]。

1.2 挤压法

挤压法，首先将芯材均匀分散在海藻酸钠溶液中形成混合物，通过滴注工具将该混合物滴入氯化钙溶液中，海藻酸钠的Na+被Ca2+替换并硬化形成颗粒的过程。挤压法是最简单的生产粒径均匀的海藻酸钠微胶囊方法。挤压法制备微胶囊的粒径取决于海藻酸钠浓度、注射工具锐孔、锐孔到氯化钙液面的距离[17]。挤压法的不足为微胶囊的粒径范围为数百微米到毫米之间，直径较大。例如，LOTFIPOUR等利用响应面方法优化了氯化钙和海藻酸钠浓度、硬化时间后，得到直径为1.3 mm ～ 1.7 mm的嗜酸乳杆菌微胶囊，包埋率达到98%以上[18]。CHAN等试图将挤压法制备微胶囊的工艺数字化，以临界参数 (Oh) > 0.24建立了制备微胶囊的工艺模型[19]。LIM等优化Ca2+浓度、壳聚糖浓度、制备工艺后发现微胶囊直径与针孔直径显著相关，也建立了制备微胶囊的模型。该模型的预测结果与实际值的偏差只有3.6%[20]。因此，挤压法是一种可靠的制备较大直径微胶囊的方法。

1.3 乳化凝胶法

乳化凝胶法通过海藻酸钠与交联剂进行凝胶化得到微胶囊。乳化凝胶法可以制备粒径小于100 μm的微胶囊，而且其实验设备简单，成本低。乳化凝胶化分为内部凝胶化和外部凝胶化(图1)。外部凝胶化和内部凝胶化的区别在于微胶囊内、外部硬化时间的不同。内部凝胶化表示先形成内核，然后再逐渐形成微胶囊颗粒。外部凝胶化表示核心凝胶化之前表面已经发生凝胶化，从而使颗粒具有刚性表面和柔软内核[21]。内部凝胶化制备的微胶囊通常较软且具有高聚集性。在较高的Ca2+浓度下，内部凝胶化制备的微胶囊包埋效率和释放速率较低[9]。外部乳化法制备的微胶囊的粒径分布较宽，内部乳化法制备的微胶囊粒径普遍较小且分布均匀。例如，SONG等通过乳化内部凝胶化和乳化外部凝胶化技术制备了海藻酸钠酵母微胶囊，通过外部凝胶化方法制备的微胶囊粒径为35 μm ～ 863 μm。而通过内部凝胶化制备的微胶囊粒径范围为35 μm ～ 373 μm[22]。

图1 内源乳化法和外源乳化法制备微胶囊的原理示意图

1.4 层层组装法

层层组装法利用逐层交替沉积的方法，借助各层分子间的相互作用(静电引力、氢键、配位键等)，自发形成结构完整、性能稳定、具有某种特定功能的分子聚集体或超分子结构的过程。层层组装法可以制备出几百到几千纳米范围内的中空微胶囊。层层组装法的优点主要在于在纳米尺度上对微胶囊直径、组成、结构、形态和囊壁厚度的精确控制。ZHAO等以天然多糖壳聚糖(CS)和海藻酸钠(SA)为载体，采用层层组装法制备了百里香精油微胶囊(TMS)。百里香精油微胶囊的抑菌效果均优于未制备微胶囊的百里香油。当温度从37 ℃升至121 ℃时，百里香精油微胶囊的抑菌率由88.0 %升高到99.8%，表明百里香精油微胶囊可作为天然抗菌剂在食品和制药工业中应用[23]。

2 制备微胶囊的影响因素

海藻酸钠微胶囊的粒径是影响芯材性质、微胶囊降解性、芯材与外界进行物质交换，及释放动力学的重要参数。微胶囊的最佳尺寸也根据不同芯材和应用场景的不同而变化。微胶囊粒径分布影响微胶囊体积、密度、流动性、复水性、溶解性和分散性等性能，对芯材的负载、聚集、释放和组织滞留有重要的影响。海藻酸钠种类和浓度、油相种类和浓度、表面活性剂种类和浓度、交联剂种类和浓度、交联时间、搅拌时间、转速、芯材含量都是影响海藻酸钠微胶囊制备及其粒径和粒径分布的重要因素。

2.1 海藻酸钠的种类和浓度

M/G比值小于1的海藻酸钠被称为高G，M/G比值大于1的的海藻酸钠称为高M。KENDALL等分别比较了中等粘度高G、低粘度高G、低粘度高M、中等粘度高M制备的微胶囊。结果表明高G海藻酸钠微胶囊的直径始终大于相应的高M海藻酸钠微胶囊的直径，平均粒径分别为780 μm和607 μm。因此，高M海藻酸钠相较于高G海藻酸钠更适于制备直径较小的微胶囊[24]。微胶囊的平均粒径随海藻酸钠浓度的增加而增加[25, 26]。这是由于海藻酸钠浓度的增加导致海藻酸钠溶液粘度的增加，增大了海藻酸钠液滴与油相之间的界面张力，因而形成尺寸更大的微胶囊[27]。SILVA等人通过乳化法制备海藻酸钠微胶囊过程中将海藻酸钠浓度从2%增加到3% (w/v)时，微胶囊的平均粒径从53 μm增加到112 μm，而且，粒径分布的多分散性参数SPAN从0.66增加到1.77[25]。

2.2 油相种类和浓度

乳化法制备微胶囊的过程中可以使用的油有液体石蜡[7,28]、大豆油[29]、橄榄油[30]、葵花籽油、棕榈油等。油相的粘度会影响微胶囊的尺寸和分布均匀性。WANG等人发现随着油相黏度的增加，微胶囊的平均粒径减小。当油相黏度为1 MPa·s时，微胶囊的平均直径为10 μm。当油相黏度增加到80 MPa·s时，微胶囊的平均直径减小到5 μm[31]。由此可见，通过改变油相粘度与水相粘度的比值可以调整微胶囊的粒径和尺寸分布。由于液体石蜡的高储能、温度波动小、体积变化小、安全且良好的化学和热稳定性、经济型好，其作为芯材用于微胶囊制备最广泛[32]。

2.3 表面活性剂种类和浓度

表面活性剂的作用是降低亲水性分子和疏水性分子之间的界面表面张力，从而形成稳定的乳液，并防止乳液液滴聚结形成离散的微球[33]。表面活性剂有助于修饰微球使表面平滑[13]。常用的疏水性乳化剂Span80、Span85，聚甘油聚蓖麻油酸酯(PGPR)被广泛用作表面活性剂。亲水亲脂平衡(HLB)是衡量表面活性剂用于微胶囊制备的重要参数。HLB在8～18范围内的乳化剂表示亲水性，适用于水包油(O/W)型乳化剂。而HLB值在3.5～6之间的油包水(W/O)型乳化剂被称为亲脂性表面活性剂[34]。W/O型乳液HLB值较高的表面活性剂可产生更稳定的乳液。因此，乳液热稳定性依赖于表面活性剂的HLB值。对于结构和物理性质相似的表面活性剂，较高C/H比引起其极性不同，导致表面活性剂分散不均匀、乳液不稳定[34]。例如聚甘油蓖麻醇酸酯(PGPR)和Span80就是常用的表面活性剂。PGPR可以很好地溶解于向日葵油和玉米油中[35]。Span80能够较好地溶解于液体石蜡中[13]。表面活性剂浓度的增加会降低微胶囊的粒径和微胶囊粒径分布[9]。Span80浓度的增加减小了乳液中海藻酸钠与油相之间的界面张力，形成更小粒径的微胶囊。ALNAIEF等评估了Span80浓度对微胶囊尺寸的影响。结果表明当Span80含量从0%增加到3%(w/v)时，微胶囊平均粒径从259 μm降低到115 μm[36]。

2.4 交联剂种类和浓度

Ca2+、Sr2+、Ba2+离子等二价阳离子常作为微胶囊的交联剂。其中，Sr2+和Ba2+离子具有中等毒性，而Ca2+离子无毒性。因此，Ca2+离子是最广泛使用的交联剂[21]。CaCl2、Ca-EDTA或CaCO3是最常见Ca2+离子来源[29]。当Ca2+离子被引入海藻酸钠聚合物溶液中时，进入带负电荷海藻酸钠分子之间形成网状结构，被称为“蛋盒”模型。交联剂浓度太低时凝胶交联度不够，包埋不完全，内容物易流失。而交联剂浓度太高时，形成的空间网状结构孔径小，分子联结紧密，影响分子的扩散。因此，通过调整交联剂浓度可以控制细胞、蛋白质和药物的释放。BAIMARK等发现负载蓝色葡聚糖的微胶囊在0.5%和1.25% Ca2+浓度下聚集[37]。这是Ca2+浓度过低，不足以使微胶囊硬化而导致微胶囊相互聚集。CaCl2浓度的增加使海藻酸钠和CaCl2之间的高度交联并收缩，导致微胶囊粒径略有减小。CHO等制备白藜芦醇微胶囊时将CaCl2浓度从0.5%升高到1%后，微胶囊的平均粒径从244.0 μm减小到217.3 μm[38]。

2.5 交联时间

通常交联时间对挤压法和乳化凝胶法制备的微胶囊的形态没有显著影响，LOTFIPOUR等人在使用挤压法制备微胶囊过程中，将交联时间从15 min增加到60 min，微胶囊粒径从1.34 mm增加到了1.35 mm[18]。但交联时间对载药材料的稳定性有较大影响。过短的交联时间导致海藻酸盐溶液凝胶不完全，从而降低包封率。交联时间延长使更多的Ca2+扩散到微胶囊中取代药物，从而减少了药物包封率。如RAHMAN等人报道交联时间从10 min增加到30 min后，包封率从84.3%下降到46.5%[39]。

2.6 搅拌速度

挤压法中搅拌速度对微胶囊尺寸没有显著影响。乳化法中随着搅拌速度的增加，微胶囊的平均粒径减小，且粒径分布范围逐渐增大。搅拌速度过小时，形成的微胶囊成球形较差，聚集严重，包埋产率低。这是转子顶端的剪切应力大于搅拌中心位置，给予乳状液不均匀的能量分布，导致粒径分布范围增大[22]。ZHAI等使用转速1 000 r/min制备的微胶囊的粒径范围为1 μm ～ 4 μm，以1 300 r/min制备的微胶囊的粒径范围为0.8 μm ～ 2.3 μm，以1 600 r/min转速制备的微胶囊的粒径范围为0.3 μm ～ 2.3 μm[40]。

3 海藻酸钠微胶囊在微生物包埋方面的应用

微生物微胶囊不仅可以保护微生物免受有害环境的影响，而且可以控制释放。以海藻酸钠与其它材料混合制备微胶囊调整壁材、包封技术、包藏手段可以满足多种微生物微胶囊的制备[41]。目前包埋的微生物主要是益生菌类，例如乳杆菌等。益生菌也必须能够通过粘附定植在小肠内。益生菌面临的最大挑战是保持益生菌的存活能力[42]，微胶囊化提高了益生菌的生存能力，在食品工业中得到广泛的应用。微生物微胶囊也具有延长货架期、提高存活率[43-46]。表1列出了制备多种微生物微胶囊及其效果。目前主要采用乳化法制备微生物微胶囊。除了螺旋藻的包埋率为44.5%外，其它微生物，例如益生乳杆菌、保加利亚乳杆菌、假单胞菌、植物乳杆菌、酿酒酵母、嗜酸乳杆菌的包埋率都在87%及以上。而且，微胶囊使微生物的存活率有了显著提高。这说明微胶囊技术为微生物的应用提供了良好的基础。

表1 近年来使用海藻酸钠为壁材制备微胶囊的代表性研究

4 展望

海藻酸钠微胶囊在生物活性物质、微生物包埋中具有光明前景。但其制备技术仍然面临一些理论和应用方面的挑战。例如微胶囊制备工艺的控制[52]，内容物释放的复杂性，微胶囊核心材料载荷/释放机制不清楚[53]。海藻酸钠微胶囊的研究将主要集中在以下两方面：1、海藻酸钠官能团的定向功能化改性将是海藻酸钠微胶囊高效利用技术的一个重要方向。总结藻酸钠中特征化学键的断裂方式和规律，从而实现海藻酸钠的定向改性。YU等人将疏水性分子连接到海藻酸钠上，采用内源乳化法制备两亲性水凝胶的牛血清白蛋白(BSA)微胶囊。结果表明疏水性物质聚乙酸乙烯酯的引入能有效延缓BSA的释放，而且聚乙酸乙烯酯在海藻酸钠上取代度越高，BSA释放速率越慢[54]。2、改进海藻酸钠微胶囊制备技术。以海藻酸钠作为壁材的新型微胶囊技术正成新热点。MOGHADDAM等人采用熔体同轴电喷雾电离法制备海藻酸钠为壁材、正十九烷为芯材的相变微胶囊。结果得到直径小于100 μm的微胶囊[55]。微胶囊的粒径可以通过工作电压、进给速率、针到集电极的距离和针径进行控制。这些技术的发展就更有利于微胶囊的制备，有效地促进微胶囊在生物医药、食品工业和工业微生物等领域的发展。