14株北京地区犬细小病毒分离毒株的VP2、NS1基因序列分析

2021-03-01李少晗由欣月范君文郝雲峰崔尚金

畜牧兽医学报 2021年1期

李少晗，由欣月，范君文，徐一，郝雲峰，崔尚金，秦彤*

(1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193； 2. 兽用药物与兽医生物技术北京科学观测站，北京 100193； 3. 北京市动物疫病预防控制中心，北京 102629；4. 中国动物疾病预防控制中心，北京 100125)

犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)引起的，以出血性肠炎和心肌炎为主要特征的犬病毒性传染病。该病在全球范围内广泛流行，是危害犬类的重要传染病之一。CPV是一种无囊膜的单股负链DNA病毒，其基因组编码两个结构蛋白(VP1和VP2)和两个非结构蛋白(NS1和NS2)[1]。VP2是CPV主要的衣壳蛋白，抗原性较强，可以诱导产生高水平的中和抗体，且在决定病毒的宿主范围和组织趋向性方面发挥着重要作用[2-3]。NS1蛋白具有ATP酶和解旋酶的功能，能够调控其他蛋白的表达，且与病毒DNA的复制、转录以及诱导细胞凋亡等过程具有密切联系[4-5]，目前，对NS1基因的研究还不够充分。

最初的CPV-2型在鉴定后不久就开始产生抗原变异。1978年，两个新型抗原突变体出现：CPV-2a和CPV-2b型，与CPV-2相比，CPV-2a的VP2包含了5个氨基酸位点的突变(Met87Leu、Ile101Thr、Ala300Gly、Asp305Tyr、Val555Ile)；1984年，另一个突变体CPV-2b被发现，其VP2发生Asn426Asp和Ile555Val两个位点的突变[6]。随后，CPV-2a和CPV-2b VP2基因发生Ser297Ala的突变，产生了New CPV-2a和New CPV-2b变异株[7-8]；2000年，在意大利首次报道了另一种新颖的抗原变体，其特征是Asp426Glu，遂命名为CPV-2c[9]，并快速在多个国家传播流行。相对于最初的CPV-2，抗原突变体CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c对犬的致病性更高，且病毒的宿主范围不断扩大[10]。

本研究从北京地区采集的犬粪便拭子成功分离鉴定到14株CPV毒株，并对其VP2和NS1基因进行序列分析，以期了解北京地区当前CPV的流行趋势，为控制该病的传播提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集及处理

从北京地区宠物医院收集了17份疑似细小病毒感染的犬粪便拭子，样品信息见表1。将粪便拭子置于1 mL含10%甘油的PBS(pH 7.2)中，待PBS浑浊后，于4 ℃、12 000 r·min-1条件下离心10 min，取200 μL上清液用0.22 μm滤器过滤除菌，制备好的样品于-20 ℃保存，用于病毒DNA的提取。

表1 临床样品采集的详细信息Table 1 Details of the isolated CPV strains

1.2 DNA提取及PCR鉴定

采用艾德莱公司的DNA快速提取试剂盒提取样本DNA。根据VP2基因保守序列设计引物，序列：IdenP1：5′-TGATGGAGCAGTTCAACCAGA-3′，IdenP2：5′-TCAGATCTCATAGCTGCTGGA-3′，扩增片段大小为574 bp。引物由北京华大基因公司合成。PCR反应体系：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，IdenP1、IdenP2各1 μL，DNA模板2 μL， ddH2O补足至20 μL。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 病毒的分离及鉴定

经PCR鉴定为阳性的样本用于病毒的分离。将样品上清液接种至刚刚传代未贴壁的F81细胞悬液中，吹打混匀后，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中静置培养，每隔12 h观察细胞病变(CPE)。当CPE达到80%时收获病毒，反复冻融3次后，对病毒进行传代。待CPE稳定后，按照Reed-Muench方法计算病毒的TCID50。并进行间接免疫荧光(IFA)鉴定。

1.4 分离毒株VP2、NS1全基因的扩增及克隆

利用提取的样本DNA，对VP2、NS1全基因进行扩增，扩增片段大小：VP2基因1 755 bp，NS1基因2 007 bp。引物序列：VP2-F：5′-CGGGATCCATGAGTGATGGAGCAGTTCAA-3′，VP2-R: 5′-GG-AATTCTTAGTATAATTTTCTAGGTGCTAGTT-3′；NS1-F：5′-GACCGTTACTGACATTCGC-3′，NS1-R: 5′-CGGCGTCAGAAGGGTT-3′。PCR反应体系：LATaq酶0.5 μL，10×LA BufferⅡ 5 μL，dNTP Mixture 8 μL，DNA模板2 μL，引物各1 μL，ddH2O补足至50 μL。将扩增的VP2和NS1基因克隆到pMD18-T载体(TaKaRa公司)中，并送北京华大基因公司进行测序。

1.5 分离毒株VP2、NS1基因的遗传进化分析

使用DNAStar软件对测序结果进行分析，并根据VP2基因中关键氨基酸位点对分离毒株进行基因型鉴定。从GenBank中检索来自世界各地的29个细小病毒序列，在Mega 6.0中使用最大似然法评估VP2和NS1的系统发育关系(重复数n=500)。

2 结果

2.1 病毒的分离鉴定

经PCR鉴定，17份临床病料为CPV阳性。将病料接种F81细胞，盲传3代后，14株毒株能够引起典型的CPE，PCR和IFA检测均为阳性(图略)，成功分离到14株CPV，分离株在F81细胞上生长良好，病毒滴度为106.19～106.76TCID50·mL-1(表1)。

2.2 CPV基因型的鉴定及VP2基因氨基酸位点的突变分析

获得14个毒株NS1和VP2基因完整ORF序列，426位氨基酸的突变被用来区分CPV-2a (426Asn)、CPV-2b (426Asp)和CPV-2c (426Glu)，297位氨基酸的差异用来区分CPV-2a/2b与New CPV-2a/2b(Ser297Ala突变被用作“New CPV-2a/2b”的标记)[8, 11]。14个CPV毒株中，7株为New CPV-2a亚型(CPV-BJ01-1、CPV-BJ01-2、CPV-BJ01-3、CPV-BJ01-6、CPV-BJ02-1、CPV-BJ02-3、CPV-BJ02-4)，7株为CPV-2c亚型(CPV-BJ01-5、CPV-BJ01-8、CPV-BJ01-9、CPV-BJ01-10、CPV-BJ02-2、CPV-BJ02-6、CPV-BJ02-7)，未发现CPV-2a、CPV-2b或New CPV-2b亚型的毒株。

VP2蛋白共有6个突变的氨基酸位点(第5、13、370、426、440、574位)，其中,仅有1样本(CPV-BJ01-9)在第5位和13位氨基酸发生突变(第5位：A→G，13位P→S)，有4个样本(CPV-BJ01-1、CPV-BJ01-3、CPV-BJ01-8、CPV-BJ02-1)在第574位发生E→K氨基酸突变；此外，VP2基因上15个核苷酸发生同义突变，对氨基酸序列没有影响。这些结果表明，少数氨基酸突变(残基5、370和440)被保存下来，随着CPV不断传播，新的氨基酸突变(13和574 aa)频繁发生。

2.3 NS1氨基酸位点的突变分析

NS1出现12个氨基酸位点的突变(第19、33、60、293、544、545、572、583、588、624、630、656位)，其中，第19、33、293、583、588、656位氨基酸仅发生1次突变(CPV-BJ02-6毒株第19位：K→R，CPV-BJ01-10毒株第33位：D→G，CPV-BJ01-9毒株第293位：V→F，CPV-BJ01-2毒株第583位：E→K，CPV-BJ02-4毒株第588位：S→N，CPV-BJ01-6毒株第656位：S→F)。另外，NS1基因上28个核苷酸突变为同义突变，对氨基酸序列没有影响。

2.4 VP2、NS1基因的遗传进化分析

VP2基因进化分析表明，大部分的CPV-2c亚型毒株(CPV-BJ01-8、CPV-BJ02-7、CPV-BJ01-5、CPV-BJ02-2、CPV-BJ01-10)与2016年广西南宁地区分离毒株(MK332001、MK332007)亲缘关系密切，CPV-BJ01-9株与2014年吉林地区分离株(KT162005)亲缘关系密切，另外1株(CPV-BJ02-6)与2014年黑龙江分离毒株(KT156832)亲缘关系密切，分离毒株与国外毒株明显分离(图1)；大部分的new CPV-2a亚型毒株(CPV-BJ02-1株除外)均与广西南宁或吉林长春地区的分离株聚集在一起，说明本次分离毒株与广西或吉林地区分离毒株具有相同的起源。NS1基因系统进化分析发现，虽然14个毒株分别属于New CPV-2a和CPV-2c亚型，但它们的NS1基因都与New CPV-2a毒株亲缘关系较近(图2)。

图1 犬细小病毒VP2基因的遗传进化分析Fig.1 Maximum-likelihood tree based on VP2 gene sequences of canine parvoviruses (CPVs)

图2 犬细小病毒NS1基因的遗传进化分析Fig.2 Maximum-likelihood tree based on NS1 gene sequences of canine parvoviruses (CPVs)

3 讨论

尽管疫苗已广泛应用，犬细小病毒仍是目前危害犬最重要的肠道病原之一，因此，进行持续的流行病学监测具有重要意义。对NS1和VP2基因的序列分析发现，除了已有报道的突变位点外，本研究首次发现了NS1基因上第19、33、293、588、624、656位氨基酸的突变，以及VP2基因上两个新的突变位点(13和574 aa)。这可能归因于新的选择压力，随着CPV的传播NS1、VP2基因仍在不断地发生突变，未来有可能会出现新的毒株。然而，这些突变位点是否与NS1、VP2发挥功能有关仍需进一步研究。

在基因系统进化分析中，虽然14个毒株分别属于New CPV-2a和CPV-2c，但是它们的NS1基因都与New CPV-2a毒株亲缘关系密切，这一现象可用于解释New CPV-2a和CPV-2c之间的重组。混合感染和连续的单向链置换复制机制可能有助于重组的发生[12]。从VP2和NS1基因的系统发育分析可以得出两个结论：1)即使VP2基因相同，NS1基因也可能不同。即拥有相同VP2基因序列的两种病毒不一定是同一株病毒；这可以解释CPV-BJ02-2、CPV-BJ02-7和CPV-BJ01-8之间的关系，CPV-BJ01-1和CPV-BJ02-3之间的关系，CPV-BJ01-6和 CPV-BJ02-4以及CPV-BJ01-5和 CPV-BJ01-10之间的关系；2)可能CPV毒株VP2基因间关系不能完全代表NS1基因间的关系。例如，从VP2基因系统进化分析来看，CPV-BJ01-5、CPV-BJ01-8、CPV-BJ01-9、CPV-BJ01-10、CPV-BJ02-2、CPV-BJ02-6、CPV-BJ02-7 7个毒株虽属于CPV-2c型，但其NS1基因却与New CPV-2a亲缘关系密切，造成这种差异的原因尚不完全清楚，但选择压力或重组可能有助于解释VP2和NS1相互冲突的系统发育树。对于病毒来说，表面抗原和内部抗原经历的选择压力不同，所以VP2比NS1的变异频率更快。因此，病毒频繁变异可能是逃避宿主免疫监视的重要因素[13]。