鉴别非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒野毒株二重TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

2021-03-01王淑娟班付国王东方赵雪丽谢彩华马震原杨海波闫若潜

畜牧兽医学报 2021年1期

王淑娟，班付国，王东方，刘影，赵雪丽，谢彩华，王翠，马震原，杨海波，柴茂，闫若潜

(河南省动物疫病预防控制中心，郑州 450008)

非洲猪瘟(African swine fever, ASF) 是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性、高度接触性传染疫病[1]，可引起猪高热、精神沉郁、皮肤发绀、食欲废绝、出血性病变和共济失调，并伴有严重的血小板和淋巴细胞减少，感染动物通常在感染后10～14 d内死亡，病死率可达100%[2]。ASFV基因组为双链DNA，大小170～194 kb[3]。病毒基因可编码200多种蛋白质，其中，结构蛋白有54种，P72是一种结构蛋白，是病毒衣壳的主要组成部分，P72基因序列保守，不同毒株之间都有相同的保守序列[4]。

猪瘟(classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(CSFV) 引起的一种高致死性、烈性传染病[5]，以稽留高热、出血、母猪流产为主要特征。该病主要通过呼吸道和消化道传染，传播速度快，发病率和死亡率都很高，给全球养猪业带来巨大的经济损失[6-7]。CSFV 属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，为单股正链RNA病毒。CSFV基因组全长12.3 kb，主要由5′非编码区(5′UTR)、开放阅读框(ORF)和 3′非编码区(3′UTR)3部分组成，5′UTR 由360～374个碱基组成，具有很高的保守性，能够形成复杂稳定的二级结构[8]。

非洲猪瘟和猪瘟引起的临床症状极为相似，必须借助实验室检测进行鉴别诊断。目前，非洲猪瘟病毒的检测方法很多，血清学方法有间接 ELISA、阻断 ELISA和间接荧光抗体试验；病原学方法有病毒的细胞培养和分离、直接免疫荧光、双抗体夹心ELISA、普通PCR和荧光定量PCR (FQ-PCR) 等，其中，OIE 推荐的普通PCR和荧光定量 PCR 是最为常用的实验室检测方法[9]。现有的CSFV诊断方法有免疫荧光、ELISA、病毒分离、RT-PCR等，但这些方法都存在敏感性、特异性低及耗时等不足，且不能区分野毒株和疫苗株[10-12]。

在已有的研究基础上，作者根据ASFV的P72基因和CSFV的5′UTR非编码区序列保守的特点，分别设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针，可在一个反应体系内同时检测ASFV和CSFV野毒株，为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异的临床检测方法。

1 材料与方法

1.1 阳性物质和毒(菌)株

ASFV目的基因由宝生物工程(大连)有限公司合成；猪瘟活疫苗购自广东永顺生物制药股份有限公司；灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、副猪嗜血杆菌(HPS)等均由河南省动物疫病预防控制中心实验室提供。

1.2 仪器设备与主要试剂

全自动核酸提取仪，美国Thermo公司产品；荧光PCR仪，美国ABI公司产品；PCR扩增仪，德国Biometra公司产品；凝胶成像分析系统，美国Alpha Innotech公司产品；台式高速冷冻离心机，美国Heraeus公司产品；核酸提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司；PrimeScript RT Master Mix、ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、酶抑制剂等均购自宝生物工程(大连)有限公司；M-MLV反转录酶、pGEM-T Easy载体等购自Promega公司。

1.3 标准品的制备

利用全自动核酸提取仪从ASFV人工合成片段中提取核酸，即为ASFV DNA，-20 ℃冻存备用。利用全自动核酸提取仪从CSFV野毒株阳性样品中提取核酸，并用随机引物反转录成为cDNA，-20 ℃冻存备用。采用PCR方法分别扩增ASFV的P72基因和CSFV野毒株的5′UTR非编码区目的基因，并将阳性扩增产物分别克隆入pGEM-T Easy载体中，筛选阳性重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司，采用T7和SP6引物进行测序。测序正确的ASFV的P72基因和CSFV的5′UTR非编码区基因的阳性重组质粒(分别命名为pGEM-ASFV、pGEM-CSFV)，应用分光光度计测定其OD260 nm和OD280 nm值及OD260 nm/OD280 nm值，共重复5次，参考Kim等[13]介绍的方法计算其浓度，获得ASFV和CSFV阳性标准品，-20 ℃保存备用。

1.4 引物和探针的设计和合成

根据ASFV的P72基因和CSFV的5′UTR非编码区序列保守的特点，分别比对GenBank中ASFV的P72基因和CSFV的5′UTR非编码区序列，应用Primer Premier6.0基因分析软件，设计两对特异性引物对和两条TaqMan MGB探针，分别命名为ASFV-P1、ASFV-P2、ASFV-Probe-P3、CSFV-P4、CSFV-P5、CSFV-Probe-P6，引物序列见表1。引物和探针均由Invitrogen公司合成。

表1 二重TaqMan MGB FQ-PCR引物和探针序列Table 1 The primers and probes sequences of duplex TaqMan MGB FQ-PCR

1.5 反应体系与条件的优化

pGEM-ASFV、pGEM-CSFV重组质粒分别稀释至终浓度1.0×105拷贝·μL-1作为检测模板，P1/P2、P4/P5引物对分别稀释至终浓度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0 μmol·L-1，Probe-P3、Probe-P6探针分别稀释到终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0 μmol·L-1，应用荧光PCR仪采用矩阵法筛选不同浓度的针对pGEM-ASFV和pGEM-CSFV扩增的引物/探针组合；在56、57、58、59、60、61和62 ℃的退火温度下进行扩增。筛选鉴别ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR最佳引物浓度、探针浓度和最佳反应条件。

1.6 敏感性试验和标准曲线的建立

将pGEM-ASFV和pGEM-CSFV阳性重组质粒分别进行10倍系列稀释，2种质粒按1∶1比例混合，每种质粒终浓度调整为1.0×106～1.0×100拷贝·μL-1，共7个稀释度，以纯水为阴性对照，按优化好的FQ-PCR反应条件进行ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR敏感性试验。分别以pGEM-ASFV和pGEM-CSFV阳性重组质粒起始模板浓度的对数为X轴，以FQ-PCR循环次数Ct值为Y轴作回归曲线，建立ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法的标准曲线。

1.7 特异性试验

对猪瘟病毒疫苗株(CSFV-Vac)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、副猪嗜血杆菌(HPS)、阴性对照等提取核酸并将CSFV-Vac、PRRSV、JEV核酸进行反转录，同时，以ASFV和CSFV阳性标准品为阳性对照，按优化好的反应条件进行二重FQ-PCR扩增以验证该方法的特异性。

1.8 重复性试验

分别将3个浓度的10倍系列稀释的pGEM-ASFV和pGEM-CSFV阳性重组质粒等量混合物(每种质粒终浓度1.0×105～1.0×103)按照优化的FQ-PCR反应条件进行扩增，每个系列设定3个重复，分成3个批次进行验证该方法的重复性。

1.9 应用试验

对20份疑似CSFV感染样品(样品编号：1～20)、10份临床疑似ASFV感染样品(样品编号：21～30)和20份健康猪样品(样品编号：31～50)分别采用本研究建立的鉴别ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法和猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法检测进行实验室检测，同时，以ASFV和CSFV阳性标准品为阳性对照，以纯水为阴性对照。对这些方法的检测结果进行比较分析。

2 结果

2.1 标准品浓度测定

计算pGEM-ASFV、pGEM-CSFV质粒DNA溶液的浓度分别为8.75×1010、7.96×1010拷贝·μL-1，分别定量稀释至1.0×100～1.0×106拷贝·μL-1。

2.2 鉴别ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法反应体系与反应条件的优化

本研究对引物与探针浓度进行优化，以提高反应的扩增效率与敏感度。优化出25 μL反应体系：ASFV-P1、ASFV-P2、CSFV-P4、CSFV-P5终浓度各为0.4 μmol·L-1，探针ASFV-Probe-P3终浓度为0.4 μmol·L-1，探针CSFV-Probe-P6终浓度为0.6 μmol·L-1，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，10×ExTaq酶缓冲液2.5 μL，5 U·μL-1ExTaqDNA聚合酶0.3 μL，1.0×105拷贝·μL-1的质粒模板各2 μL，去离子水补足至总体积25 μL。最佳反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，40个循环。最佳反应条件下的二重FQ-PCR结果见图1。

1.ASFV重组质粒; 2. CSFV重组质粒; 3. 阴性对照; 4～10. CSFV-Vac、PRRSV、PRV、PCV2、PPV、JEV和HPS1. Recombinant plasmid of ASFV; 2. Recombinant plasmid of CSFV; 3. Negative control; 4-10. CSFV-Vac, PRRSV, PRV, PCV2, PPV, JEV and HPS图1 鉴别ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法建立及特异性试验结果Fig.1 Establishment and specificity analysis of duplex TaqMan MGB FQ-PCR

2.3 标准曲线的建立、敏感性试验和判定标准的初步确定

二重FQ-PCR对pGEM-ASFV和pGEM-CSFV阳性重组质粒的最低检出限均为1.0×101拷贝·μL-1(图2)。由敏感性检测结果建立ASFV标准曲线，相关系数R2为0.996，斜率为-4.161，截距为39.17，从而得出拷贝数(x)与Ct值之间的线性关系表达式：y=-4.161lgx+39.17(图3A)；由敏感性检测结果建立CSFV型标准曲线，相关系数R2为0.997，斜率为-3.582，截距为37.87，从而得出拷贝数(x)与Ct值之间的线性关系表达式：y=-3.582lgx+37.87(图3B)。

A. ASFV；B. CSFV；1～7. 分别对应的质粒浓度1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100拷贝·μL-1；8、9.阴性对照A. ASFV; B. CSFV; 1-7. The plasmid concentrations is 1.0×106, 1.0×105, 1.0×104, 1.0×103, 1.0×102, 1.0×101, 1.0×100copies·μL-1, respectively; 8, 9. Negative control图2 ASFV、CSFV FQ-PCR方法的敏感性试验Fig.2 Sensitivity tests of ASFV, CSFV FQ-PCR

A. ASFV；B. CSFV; x为拷贝数A. ASFV; B. CSFV; x. Copies number图3 ASFV、CSFV FQ-PCR方法标准曲线Fig.3 The standard curve of ASFV, CSFV FQ-PCR

根据标准曲线，初步将判定标准定为如果被检样本的PCR反应体系通道出现2条特定的扩增曲线，且Ct值≤33.0，则可判定为非洲猪瘟病毒及猪瘟野毒株核酸阳性；如果被检样本的PCR反应体系通道无特定的扩增曲线，且Ct值>35.0或无，则判定为非洲猪瘟病毒及猪瘟野毒株核酸阴性；如果被检样本的PCR反应体系通道出现特定的扩增曲线，且33.0

2.4 特异性试验

ASFV、CSFV阳性标准品FQ-PCR扩增Ct值分别为17.02和19.87且出现特定的扩增曲线；阴性对照和CSFV-Vac、PRRSV、PRV、PCV2、PPV、JEV、HPS等均未出现特定的扩增曲线(图1)，说明本方法特异性良好。

2.5 稳定性和重复性试验

ASFV FQ-PCR方法和CSFV FQ-PCR方法批内重复和批间重复试验变异系数(CV值)均在3%以下，扩增效率稳定，表明建立的鉴别ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法具有很好的稳定性和重复性。

表2 ASFV FQ-PCR方法稳定性和重复性试验Table 2 The results of ASFV FQ-PCR stability and repeatability

表3 CSFV FQ-PCR方法稳定性和重复性试验Table 3 The results of CSFV FQ-PCR stability and repeatability

2.6 应用试验

采用本研究建立的鉴别ASFV、CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法对50份临床样品进行检测，共检测出17份CSFV阳性、3份ASFV阳性，检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法检测结果完全一致，表明本研究建立的鉴别ASFV、CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法具有较高的特异性和敏感性，可用于临床ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断。

3 讨论

ASF最早于1921年在肯尼亚暴发，随后相继扩散至欧洲、中美洲、非洲和亚洲的多个国家[14]，该病病程短、发病率和死亡率几乎达100%，中国首例非洲猪瘟疫情于2018年8月在辽宁沈阳暴发[15]，随后疫情持续在我国迅速蔓延开来，严重威胁着我国养猪业的发展。CSF传播速度快，发病率和死亡率都很高，给全球养猪业带来巨大的经济损失。这两种疫病都被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告的动物疫病，也是中国动物病原微生物名录中规定的一类动物传染病[16-19]。

虽然距首次发现ASFV至今已将近百年，但目前世界上仍没有可有效预防ASFV感染的疫苗，也无有效的治疗药物，仅能依赖有限的抗原检测方法对ASFV感染开展早期诊断，进而通过扑杀感染动物来实现对ASF疫情的控制。目前,我国也有针对猪瘟的疫苗，但疫苗生产企业众多，疫苗质量参差不齐，免疫失败时有发生，且CSF的临床表现趋于复杂化，典型性病例减少[20]，单凭临床症状很难确诊。且由于 ASF 与CSF等其他出血性猪病的发病症状非常相似，很难通过临床诊断的方法进行区分，只能依靠实验室方法进行鉴别诊断。因此，建立对 ASFV和CSFV野毒株快速、特异、敏感的鉴别诊断方法对疫情防控尤为重要。

国内外很多学者建立了ASFV和CSFV的PCR或荧光定量PCR方法，Aguero等[21]根据ASFVVP72 基因设计引物，建立了用于ASFV早期感染的快速诊断方法；Basto等[22]建立了可用于检测蜱虫体内ASFV的套氏PCR方法；崔尚金等[23]建立了ASFV的高效纳米PCR检测方法；King等[24]、黄萍等[25]、Tignon等[26]多个研究团队先后以ASFVVP72基因为靶基因建立基于TaqMan的ASFV实时荧光定量PCR检测方法；Mckillen等[27]根据9GL基因建立MGB探针实时荧光定量PCR检测方法。Risatti等[28]首次建立了CSFV的FQ-PCR方法；Liu 等[29]将CSFV检测一步RT-PCR方法与FQ-PCR方法进行了比较，认为前者适合低成本检测，后者能实现高通量； Ciglenecki等[30]对染料法和MGB探针法进行了比较，认为MGB 探针法定量优于前者。但是这些PCR检测方法的灵敏度和特异性均相对偏低，且不能实现ASFV和CSFV的鉴别检测。

本研究建立的鉴别ASFV、CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法是在同一反应体系中进行ASFV和CSFV的扩增反应，同时收集不同的荧光信号，对扩增产物进行实时检测，从而实现ASFV和CSFV野毒株的鉴别检测。本研究建立的FQ-PCR方法采用TaqMan MGB探针，与传统的TaqMan探针相比，TaqMan MGB探针缩短了探针的长度，大大提高了探针的Tm值，也降低了探针的合成成本，TaqMan MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，其本身不产生荧光信号，可大大降低本底信号的强度，使扩增结果更加特异、敏感。本研究建立的方法操作简便、速度快，可在1 h内完成ASFV和CSFV野毒株的鉴别检测。

本研究建立的鉴别ASFV、CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法是根据ASFV和CSFV野毒株基因序列保守区设计引物和探针，方法对ASFV和CSFV野毒株的最低检测模板浓度均为10 拷贝·μL-1，特异性强，稳定性和重复性良好；对50份临床样品进行检测，检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法结果完全一致。因此，本研究建立的鉴别ASFV、CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的新方法。