石榴日轮丸质量标准提升研究

禄晓艳 杨金草

甘肃省甘南藏族自治州药品检验检测中心，甘肃 甘南 74700

石榴日轮丸为常用藏药制剂(藏文读音:索吉尼美吉廊日布)，由石榴子、冬葵果、肉桂、天门冬、黄精、西藏棱 子芹、荜茇、喜玛拉雅紫茉莉、红花、蒺藜、豆蔻等 11 味药材组成，具有温补胃肾的功能,用于消化不良、腰腿冷痛、小便频数、脚背浮肿、阳痿、遗精等，是治疗胃、肾性病症的常用药之一，收载于卫生部药品标准藏药第一册[1]，但标准项下只有显微鉴别和丸剂的常规检验，没有薄层鉴别和含量测定。方中石榴子及其活性成分鞣花酸均具有抗 癌、抗痢疾性腹泻、抗氧化、降血糖和雌激素样等药理作用[2-3]；荜茇属温里药，具有温中散寒、行气止痛之功效，临床适用于胃脘冷痛、胃寒呕吐或泄泻[4]，其主要活性成分胡椒碱具有催眠、镇静、抗惊厥、抗抑郁和骨骼肌松弛等作用临床主要用于胃痛、腹泻等[5]；红花为活血化瘀的经典中药之一，其有效成分羟基红花黄色素A具有活血化瘀、抗炎、抗肿瘤等作用[6-7]。为了进一步控制该药品质量，本实验采用薄层色谱法(TLC)对石榴子、红花进行定性鉴别[8]，用高效液相色谱法(HPLC)测定该制剂中荜茇的有效成分胡椒碱含量。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 G7111A四元泵，Agilent 1260 G7115A二极管阵列检测器,Agilent 1260 G7129A自动进样器(内置柱温箱)；BT224S、CP-225D电子天平；KH-250DB型数控超声波清洗器；CAMAG WFH-201BJ薄层呈像系统(半自动点样仪及数码成像系统)。

1.2 试药 胡椒碱对照品(批号：110775-201706，供含量测定用，纯度 98.9%)；石榴子对照药材(121431-201002，供薄层鉴别用)；红花对照药材(120907-201713，供薄层鉴别用)均购自中国食品药品检定研究院；甲醇(色谱纯，默克公司)；水为超纯水，其余试剂均为分析纯；硅胶GF254薄层板、高效硅胶H薄层板(青岛海洋化工厂)；石榴日轮丸由甘南藏族自治州碌曲县西仓寺院藏医院(批号：190324、190502、190711、191006、191102)提供。

2 薄层鉴别试验

2.1 石榴子TLC鉴别 取本品3批各1 g，加乙醇5 mL，超声处理30 min，取上清液作为供试品溶液；另取石榴子对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液；再取缺石榴子的阴性对照1 g同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品及阴性对照溶液各10 μL，对照药材溶液3 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(254 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照无干扰，如图1所示。

2.2 红花TLC鉴别 取本品3批各1 g，加80%丙酮溶液5 mL，密塞，振摇15 min，静置，取上清液作为供试品溶液；另取红花对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液；再取缺红花的阴性对照 1 g 同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品、阴性对照溶液及对照药材溶液各4 μL，分别点于同一高效硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)为展开剂，展开，取出，晾干，日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性对照无干扰，如图2所示。

3 胡椒碱含量测定

3.1 色谱条件及系统适应性 试验色谱柱选用CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.06% 磷酸溶液(70∶30)；检测波长：343 nm，流速：1.0 mL·min-1，柱温：30 ℃，进样量：对照品10 μL，供试品：5 μL；理论板数按胡椒碱峰计算应不低于5000。

3.2 对照品溶液的制备 取胡椒碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含胡椒碱0.2124 mg的溶液，即得。

3.3 供试品溶液的制备 取供试品5 g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，称定重量，放置过夜，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.4 阴性对照溶液的制备 按供试品的处方和制法，制成不含荜茇的阴性样品，按“3.3”项下的方法制得阴性对照溶液。

3.5 系统适用性试验 分别精密吸取荜茇阴性对照溶液、空白溶剂(甲醇)及流动相各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。结果：在荜茇阴性对照溶液、空白溶剂(甲醇)及流动相色谱图中，在与荜茇对照品色谱峰相应的保留时间点，未见有色谱峰。结论：阴性无干扰，本品其他药材、溶剂及辅料不干扰本品的胡椒碱含量测定，基线完全分离，且峰形良好，本方法的专属性很好，如图3所示。

3.6 线性关糸考察 分别精密吸取胡椒碱对照品溶液(浓度为0.2124mg·mL-1)4、6、8、10、12、15 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值：以进样量为横坐标(X)，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，分别作图，得胡椒碱的线性回归方程为：Y=8526.85X-29.1158，r=0.9999；结果表明，胡椒碱在0.850～3.186 μg之间线性关系良好。

3.7 仪器精密度试验 取胡椒碱同一浓度对照品溶液，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定胡椒碱峰面积，RSD为0.25%，表明仪器的精密度良好。

3.8 重复性试验 称取同一样品(批号：190324)按“3.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，进行高效液相色谱分析，测定含量，结果胡椒碱的RSD为0.47%。

3.9 稳定性试验 取同一供试品溶液并于供试品溶液制备后2、4、6、8、12、24 h，分别进样1次，测定峰面积值以考虑溶液的稳定性。结果在24 h内，供试品溶液中胡椒碱峰面积稳定，RSD为0.55%(n=6)，供试品溶液在24 h分析时间内稳定性良好。

3.10 加样回收率试验 取已知含量的石榴日轮丸供试品(批号：190324)0.5 g，精密称定6份，分3组，每组2份，分别按样品中胡椒碱含有量与相应对照品加入量的比例约为1∶0.8、1∶1、1∶1.2，加入胡椒碱对照品储备液(0.2124 mg·mL-1)6.25、7.80、9.35 mL，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，依上述色谱条件进行测定，计算回收率，测得的结果见表1。

表1 胡椒碱加样回收率试验结果 (n=6)

3.11 样品的含量测定 取5批石榴日轮丸，按“3.3”项下方法制成供试品溶液。分别进样，测得峰面积积分值，计算石榴日轮丸中胡椒碱的含量。结果见表2。

表2 石榴日轮丸中胡椒碱的测定结果 (n=3，mg·g-1)

结果表明：5批石榴日轮丸指标性成分胡椒碱含量差异较小，考虑到原料含量的差异、在生产过程中的损失以及试验操作过程中的误差，结合实际生产，转移率按80%计算，并综合考虑单味药荜茇的含量限度，建议本品胡椒碱的含量限度为：本品每1 g含胡椒碱(C17H19NO3)，不得少于2.0 mg。

4 讨论

4.1 石榴子的薄层条件选择 在石榴子的薄层鉴别中，比较了乙酸乙酯加热回流提取和乙醇超声提取，环已烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶12∶3)和石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(9∶1)展开系统，硅胶G薄层板和硅胶GF254薄层板。结果表明，加热回流和超声提取效果基本一致，故选用简便、快速的超声提取，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(9∶1)展开剂展开，斑点清晰。

4.2 红花的薄层条件选择 在红花的薄层鉴别中，分别对硅胶G薄层板、硅胶H薄层板及高效硅胶H薄层板(展开剂：乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇7∶2∶3∶0.4)进行薄层色谱分析，结果以高效硅胶H板结果斑点清晰，分离度好，Rf值适中。

4.3 胡椒碱的流动相选择 在流动相的优化中，参照文献[9-12]，比较甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1磷酸溶液作为流动相时，胡椒碱的分离效果。结果表明，甲醇-0.1磷酸溶液作为流动相时，胡椒碱出峰时间较早，能够获得较好的分离效果，峰形对称性较好，该方法专属性强，测定结果准确可靠，重复性、相关性好，可用于石榴日轮丸的质量控制。

4.4 方法比较 根据科技查新报告，有关藏药石榴日轮丸的质量标准研究方面，国内仅见四川大学华西药学院王曙的“藏药石榴日轮丸的质量标准研究”[8]，研究者对石榴日轮丸进行了薄层色谱鉴别和薄层扫描含量测定研究，本研究在其研究基础上增加了石榴子的薄层色谱研究，并将胡椒碱的含量测定方法进行了改进。