藏药珊瑚通窍丸的质量控制方法探讨

张晓南 何雨桐 游 燕 曹红云 普冰清 李东娴 王京昆*

1.云南省药物研究所，云南 昆明 650111；2.云南白药集团创新研发中心，云南 昆明 650111；3.云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111；4.云南省药品和医疗器械评审中心，云南 昆明 650106

珊瑚通窍丸是迪庆州藏医院的院内制剂，为传统藏族验方，目前现行质量标准较为简单，仅有性状、薄层鉴别、乌头碱限量检查以及丸剂的制剂通则检查项。为提高其质量控制水平，为其进一步深入研究打下基础，对其质量标准的提高进行了探索性研究。

珊瑚通窍丸由珊瑚、柯子、獐牙菜、红花等二十六味药材组成，原标准没有收载含量测定项，因此本次研究的重点是珊瑚通窍丸的指标性成分含量控制研究。红花收载于2015版《中国药典》，味辛、微苦，性温，归心、肝经。具有通经活血、止痛散瘀之功效；可用于痛经、经闭、恶露不行、癥瘕痞块、心痛胸痹、瘀滞腹痛、胸胁刺痛、跌打损伤、疮疡肿痛[1]。其功效与珊瑚通窍丸开窍、通络、止痛相通，主治与珊瑚通窍丸用于“白脉病”：神志不清，身体麻木，头昏目眩，脑部疼痛，血压不调，头痛，癫痫及各种神经性疼痛也有众多相似之处，可以认为红花是珊瑚通窍丸的主要作用成分，因此选择红花作为指标性成分含量控制的主要对象。

羟基红花黄色素A是红花黄色素中的主要成分[2]，临床研究表明其具有抗凝血、抗氧化、预防脑缺血、保护血管内皮细胞和神经等作用[3-4]，其可能是珊瑚通窍丸的重要有效成分，此次研究依据药典红花项下含量测定对其含量测定方法进行探讨，以期为进一步珊瑚通窍丸功效的物质基础研究提供前期基础。

1 供试品、仪器、药品与试药

1.1 供试品 珊瑚通窍丸(迪庆州藏医院制，201705-1、201705-2、201705-3)。

1.2 仪器 美国Agilent 1260高效液相色谱仪；SK8200HP型超声波仪(上海科导)；AG285型电子天平(梅特勒-托利多)。

1.3 药品与试药 对照品羟基红花黄色素A(批号：111637-201810，纯度93.1%)由中国食品药品检定研究院提供；西红花苷-Ⅰ(批号：111588-201704 纯度88.4%)由中国食品药品检定研究院提供；所用流动相乙腈、甲醇为色谱纯，处理样品的甲醇、乙醇、磷酸均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 羟基红花黄色素A的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Agela Venusil MP C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：以甲醇-乙腈-0.7%磷酸(23∶5∶72)等度洗脱，流速：1.0 mL/min；检测波长：403 nm；进样量：10 μL。

2.1.2 溶液的制备 对照品溶液的制备:取对照品适量，精密称定，用甲醇溶解成每1 mL中含羟基红花黄色素A 0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。供试品溶液的制备:取本品粉末约1.0 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密量取25%甲醇25 mL，称定重量，超声30 min(功率300 W，频率 40 kHz)，放冷，再称重，以25%甲醇补足失重，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液即得。

2.1.3 专属性及系统适应性 试验按2.1.2溶液制备方法制备供试品溶液和阴性供试品溶液，按上述色谱条件分别进样对照品、供试品、阴性供试品各10 μL。结果如图1所示。由色谱图可以看出供试品溶液色谱中与对照品溶液色谱中有保留时间一致的色谱峰出现。

2.1.4 线性关系考察精密 称取羟基红花黄色素A(批号：111637-201810，纯度93.1%)22.52 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得对照品储备液(其中羟基红花黄色素A 0.8386 mg/ml)，精密吸取对照品储备液，稀释，进样测定，进样量 10 μL，记录峰面积，测得结果见表1。以含量(X)对峰面积(Y)进行线性回归，得回归方程：Y=3722.39X-35.15，相关系数r=0.9995。结果表明，在上述色谱条件下，羟基红花黄色素A在0.02328～2.348 μg范围内线性关系良好。

表1 线性关系测定结果

2.1.5 准确度试验

2.1.5.1 对照品溶液制备 精密称取羟基红花黄色素A(批号：111637-201810，纯度93.1%)22.52 mg 至25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为羟基红花黄色素A 0.8386 mg/mL的对照品溶液，备用。

2.1.5.2 加样回收方法 精密称取6样品(批号：201705-1，已测羟基红花红色素A含量为0.088%)，每份约0.5 g，分别加入以上对照品溶液(加入量见表2)，按2.1.2方法同法处理，所得溶液作为供试品溶液进行测定，计算回收率，结果见表2。羟基红花黄色素A回收率为90.67%～92.70%，能满足要求(要求为90%～108%)[1]，说明方法准确度良好。

表2 加样回收测定结果

2.1.6 精密度试验

2.1.6.1 仪器精密度 取配制好的对照品溶液，按上述色谱条件进样，进样量10 L，连续进样6针，保留时间及峰面积的RSD值均小于2%，结果表明本法具有良好的仪器精密度。

2.1.6.2 重复性试验 精密称取同一批号(批号：201705-1)的样品6份，按2.1.2方法制备，并按2.1.1方法测定。测得羟基红花黄色素A平均含量为0.088%，RSD为0.71%，表明本法具有良好的重复性。

2.1.7 稳定性试验 取供试品溶液按照2.1.1方法测定，分别于0、4、7、10、24 h进样，计算羟基红花黄色素A含量，结果RSD均小于3%，说明供试品溶液在24 h内是稳定的。

2.1.8 样品测定 测定3个不同批次的样品中的羟基红花黄色素A含量，结果见表3。

表3 样品测定结果表

2.2 西红花皂苷Ⅰ的含量测定

2.2.1 方法 珊瑚通窍丸的处方中含有贵细药材西红花，为进一步加强其质量的可控性，本次研究依据《中国药典》2015年版一部 二十五味珍珠丸项下的含量测定方法，测定了其标志性成分西红花皂苷Ⅰ[1]。测定方法和药典一致，高效液相色谱仪为美国Agilent 1100型，色谱柱为：Agela Venusil MP C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)。

2.2.2 结果 实验所得色谱图显示：珊瑚通窍丸中的西红花皂苷Ⅰ在此方法下能得出分离度达到1.5，理论塔板数不低于3000的色谱峰，且阴性样品无干扰，初步确定能满足含量测定的要求。测定结果见下表4。

表4 样品测定结果表

3 讨论

藏药制剂处方药味常常达到20味以上，且其中含有众多矿物药、动物药和民族民间药材的情况，含量测定指标性成分的选择，应尽量与全方的功效相呼应，优先选择药理作用与处方功效接近的成分作为定量的目标，才最有利于质量控制手段发挥最大的实际控制作用。如何选择含量测定的指标性成分、所选成分和处方的功效对应性研究成为了质量控制标准提高性研究的难点和重点，亟待加强研究。

在此次研究中，将羟基红花黄色素A作为质量控制的指标性成分就是针对以上问题的有益尝试，但羟基红花黄色素A与全处方功效的对应性推断是基于已有文献[1,3-4]，而未进行实验研究，这是本次研究的一大遗憾之处，在将来的工作中会尽力完善。

由本次研究的实验结果可以得出结论：珊瑚通窍丸中的羟基红花黄色素A能被以简便可行的方法定量测定，且阴性样品不出现相应的色谱峰，已测定的3个批次中的羟基红花黄色素A含量基本持平，能够反映红花药材投料与否和投料量的一致性，羟基红花黄色素A可以收载为珊瑚通窍丸质量标准中的含量测定项。

此次研究还进行了含量测定的另一成分西红花皂苷Ⅰ是处方中贵细药材西红花的标志性成分，对其进行检测是为了防止出现恶意减投或不投料，可将其列入质量标准的检查项，分析方法学验证研究在将来的工作中会进一步完善。为使检查项更加全面，本次研究还进行了黄曲霉毒素的含量测定和微生物限度检查，结果都能满足规定。