沙棘籽蛋白质分级提取及其氨基酸组成研究

王 晴，臧 凤，钱玉梅，李红侠，曹稳根

沙棘属胡颓子科，是我国传统的可药食两用的植物，属于国家食品药品监督管理总局列出的既是食品又是药品的物品［1］.沙棘中富含多种营养物质，包括总黄酮、维生素、有机酸、甾体、多酚等，具有抗氧化、提高免疫力、抑菌等多种生物活性［2］.沙棘籽是沙棘生产加工过程中产生的废弃物，约含有20%以上的蛋白质，且包括多种氨基酸，具有极高的应用前景［3］.本文以沙棘籽为原料，提取总蛋白，并同时进行分级分离得清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白，探究总蛋白及各分级蛋白的蛋白含量、氨基酸组成，并对其分子量进行分析，为资源的有效利用及沙棘籽的综合开发开辟有效途径.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

野生沙棘果，采摘于山西交城庞泉沟自然生态保护区；牛血清蛋白，购于北京奥博星生物技术有限公司；Marker 蛋白，购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；透析袋（截留相对分子量为8 000～14 000 Da）、石油醚、乙醇、盐酸、考马斯亮蓝R250、考马斯亮蓝G250、Bis、甘氨酸、甲醇等，购于国药集团化学试剂有限公司.

冷冻干燥剂（北京博医康实验仪器有限公司）；R-1001LN 型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；SP-723 型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；L-8800 氨基酸全自动分析仪（日立公司）等.

1.2 实验方法

（1）沙棘籽脱脂粉的制备.新鲜沙棘果去除果皮和果肉，取籽，清洗晾干后用粉碎机粉碎，石油醚浸泡籽仁粉24 h，抽滤，干燥，过80目筛，重复以上步骤三次，最后制成沙棘籽脱脂粉，低温储藏备用.

（2）沙棘籽总蛋白的制备.将沙棘籽脱脂粉按照料液比1∶16 加入去离子水于锥形瓶中，用1 mol/L NaOH 调节溶液pH 至11，并在温度为50 ℃的条件下搅拌浸提60 min，然后在4 000 r/min 的离心机下常温离心20 min 并收集上清液，所得沉渣再提取一次，合并两次离心的上清液，取上清液用1 mol/L HCl 调节pH 至5.5，再 以4 000 r/min 离心20 min 后将 所得沉渣水洗一次，将两次溶液中和后蒸发浓缩、透析、冷冻干燥即得沙棘籽蛋白质［4］.

（3）沙棘籽Osboren 分级分离.采用Osboren分级分离法［5］提取沙棘籽清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白.称取适量沙棘籽仁脱脂粉，按照料液比1∶10 添加去离子水于锥形瓶中混合均匀，室温下搅拌提取60 min，浸提液于3 500 r/min 的离心机下离心20 min，取上清液，蒸发浓缩冷冻干燥，所得样品即为清蛋白；将所得沉淀继续按照料液比1∶10 加入5% NaCl 溶液混合均匀，在室温下搅拌提取60 min，浸提液于3 500 r/min 的离心机下离心20 min，取上清液，在40 ℃条件下置于去离子水中透析72 h，每4 h 换一次去离子水，然后浓缩冷冻干燥即为球蛋白；将所得沉淀继续按照料液比1∶10 加入75%乙醇混合均匀，在室温下搅拌提取60 min，浸提液于3 500 r/min的离心机下离心20 min，取上清液，蒸发浓缩，冷冻干燥，所得样品即为醇溶蛋白；将所得沉淀继续按照料液比1∶10 加入0.2% NaOH 溶液混合均匀，室温下搅拌提取60 min，浸提液于3 500 r/min 的离心机下离心20 min，取上清液，经旋转蒸发浓缩后再进行冷冻干燥，所得样品即为谷蛋白.

（4）蛋白含量测定.考马斯亮蓝G250 100 mg，溶于50 mL 体积分数95%乙醇中，加入85%的磷酸100 mL，用蒸馏水定容至1 000 mL；牛血清蛋白10 mg，溶于蒸馏水定容至100 mL，制成0.1 mg/mL 的标准蛋白溶液；取7 只试管，分别加入标准蛋白、水和考马斯染液，即用0.1 mg/mL的标准蛋白溶液给各个试管分别加入0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL，然后用去离子水补充到1 mL，再分别加入5 mL考马斯亮蓝染液，每加完一管，立即振荡使其充分混合，依次将7 只试管内的溶液加入比色皿中，测定波长在595 nm 处的吸光值，其中1号试管作为空白，测得的吸光值清零，然后依次测定其他试管，以标准蛋白质含量为横坐标，以吸光度595 nm 为纵坐标，绘制标准曲线；取冷冻干燥后的样品，用缓冲液溶解、稀释，取稀释样液1 mL，加入5 mL 考马斯亮蓝染液，充分混合，再倒入比色皿中，在595 nm下进行比色，记录吸光值A，以标准曲线1 号试管作空白，经过换算得到样品中的蛋白质含量［6］.

（5）氨基酸组成与含量的测定.样品的前处理采用酸水解法，所以氨基酸含量测定中色氨酸含量未能检测.因为在强酸水解过程中，色氨酸与含醛基化合物作用产生黑色物质.取适量样品于水解管中，加入一定量6 mol/L的HCl 溶液，抽真空，并在真空状态下进行封口，将真空封口的水解管在110 ℃下水解24 h后取出冷却，并用去离子水定容，将定容后的溶液过滤、蒸干，再加入0.02 mol/L 的HCl 溶液在空气中放置30 min，测定组成及含量［7］.

（6）SDS-PAGE 电泳.采用SDS-PAGE 不连续缓冲系统进行电泳.聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应，能够根据蛋白质中分子量的形状、大小及所带电荷量的区别而有规律地分开.此次试验使用垂直板电泳槽，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%，采用考马斯亮蓝R250 染色，脱色，分析［8］.

1.3 数据分析方法

本次试验所得数据均采用平均值±标准差的形式进行表示.

2 结果与讨论

2.1 总蛋白及各分级蛋白含量

沙棘籽脱脂粉中总蛋白及各分级蛋白含量如表1 所示，结果显示，沙棘籽中蛋白质含量丰富，清蛋白含量最高，醇溶蛋白的含量最低，但总蛋白含量并不等于各分级蛋白含量，表明沙棘籽总蛋白中还含有其他类型的蛋白质未用Osboren 分级分离提取出来，仍残留于沉淀中.清蛋白和球蛋白具有较好的溶解性，决定沙棘籽蛋白具有良好的功能特性，为其在食品工业中的应用奠定了良好基础.

表1 沙棘籽各蛋白组分的含量/（g/100 g 脱脂粉）

2.2 氨基酸组成分析

（1）必需氨基酸及非必需氨基酸的组成及含量.如表2 所示，沙棘籽蛋白质中氨基酸含量丰富，种类齐全，除谷蛋白外，其余各蛋白中谷氨酸所占比例最高.谷氨酸在自然界中普遍存在，其在生物体内的蛋白质代谢过程中具有重要意义，不仅可以改善儿童智力发育，还能作为营养药物用于皮肤和毛发，有较高的营养价值.谷氨酸广泛用于调味剂、鲜味剂，有增香作用，可用于增强食品风味［9］.沙棘籽总蛋白中缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸，清蛋白中缬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，球蛋白中缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸含量均高于FAO/WHO 推荐模式中成人对氨基酸的需求.在非必需氨基酸中，清蛋白各氨基酸含量均为最高，且均高于其他蛋白各氨基酸含量，由此可见，沙棘籽蛋白质具有较高的营养价值.

表2 沙棘籽蛋白组分中氨基酸的组成和含量/（g/100 g 蛋白）

（2）不同种类氨基酸的分布.按照不同氨基酸的化学性质对各蛋白组分中的氨基酸归类，通过计算，得到不同类型氨基酸的分配比例，结果如表3 所示.清蛋白中非极性氨基酸、极性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸、中性氨基酸、芳香族氨基酸、含硫氨基酸的含量均为最高，球蛋白中芳香族氨基酸含量最高，且清蛋白中极性氨基酸含量最高，其余均是中性氨基酸含量最高.

（3）特殊氨基酸的含量.如表4 所示，清蛋白中支链氨基酸含量最高，支链氨基酸是机体合成蛋白质的原料，同时也是一种重要的运动营养补剂.近年来，通过研究发现，支链氨基酸具有抗衰老的功能，可影响机体蛋白质的分解和合成，还能够提高机体免疫力，对机体具有重要作用.甜味氨基酸在清蛋白中含量最高；鲜味氨基酸在清蛋白中的含量远高于其他蛋白.

2.3 SDS-PAGE 电泳分析

从图1 可以看出，沙棘籽各蛋白组分的分子质量分布广泛，条带较多.清蛋白约有14 条谱带，主要条带比较集中地分布于14.3～44.3 kDa；球蛋白大约有16 条谱带，高分子质量条带比清蛋白多，主要条带分布与清蛋白相近，这是因为采用传统的Osboren 分级分离方法难免会造成清蛋白和球蛋白的相互污染，可能造成条带相混；谷蛋白主要有9 条谱带，而且条带较浅，这可能与其溶解性较低、不易于溶解到凝胶中有关；醇溶蛋白没有清晰明显的电泳条带，可能与它溶解性较差、纯度较低有关，可见，沙棘籽各蛋白组分亚基组成比较复杂，由多种具有不同分子量的亚基组成.

表3 沙棘籽蛋白组分中不同类氨基酸的构成分布/（g/100 g 蛋白）

表4 沙棘籽组分中特殊氨基酸含量/（g/100 g 蛋白）

图1 沙棘籽不同蛋白组分的SDS-PAGE 电泳图

3 结论

本文以沙棘籽为原料，提取总蛋白，并通过对沙棘籽分级分离得到清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白，测出各蛋白组分中蛋白质含量，进行氨基酸组成分析、SDS-PAGE 电泳，表明沙棘籽中蛋白质含量丰富，氨基酸种类齐全，必需氨基酸含量均远远高于FAO/WHO 推荐模式中成人对氨基酸的需求，其中清蛋白是最主要的蛋白质类型，其各类氨基酸含量均为最高.由此可见，沙棘籽蛋白是一个氨基酸含量丰富、种类齐全、值得开发和利用的优质蛋白质，其发展前景十分乐观，且对沙棘籽的有效开发及资源的充分利用具有极其深远的意义.