细菌光修复实验的设计和改进

吕 俊，施 浩，陈思梦，孟 宇，徐 蕾

DNA 是包括人体在内绝大多数生物体的遗传物质，其稳定性是遗传保守性的基础.然而，多种因素可能导致DNA 出现损伤，进而影响遗传信息的表达和传递，导致细胞生长停滞、衰老、死亡，使机体引起炎症、甚至肿瘤等多种疾病.DNA 损伤的修复，是生物体维持DNA 正常结构，保持细胞正常功能，防止一系列疾病发生的重要手段［1-2］.由于DNA 修复的重要性，该领域的研究日益受到人们的关注.2015 年，科学家托马斯·林达尔、保罗·莫德里克、阿齐兹·桑贾尔被授予诺贝尔化学奖，以表彰他们在DNA 修复方面的卓越研究成果［3-5］.目前，在本科生物化学课程的理论教学中，DNA 的损伤和修复内容已单独列为一个章节进行讲解［6］.然而，关于DNA 损伤和修复的实验教学，目前尚属于空白.这使得学生在学习相关知识的过程中，出现理论和实践的脱节，难以深入掌握相关知识点.设计切实可行的相关教学实验，是生物化学教学中亟待解决的课题.

中短波紫外线（波长200 nm～315 nm）可导致DNA 链上相邻的嘧啶碱基发生共价交联，形成嘧啶二聚体损伤.很多生物体存在光修复酶（photolyase），可吸收利用波长为315 nm～500 nm 的长波紫外线和可见光的能量，直接修复紫外线造成的嘧啶二聚体损伤，此过程称为光修复，也是阿齐兹·桑贾尔获诺贝尔奖的研究内容之一［7］.我们以光修复现象为出发点，设计了细菌的光修复实验，并对实验进行了合理改进，使实验更加便捷、高效，以适合本科实验教学的需要.同时该实验方法也适用于光修复的相关科学研究.

1 材料与方法

1.1 器材

超净工作台、培养箱、恒温空气摇床、台式离心机、高压灭菌锅、-80 ℃冰箱、分光光度计、试管、培养皿、接种环、涂棒、酒精灯、计时器、低压汞灯（发射波长254 nm）、白色LED 光源、红色LED 光源（发射波长635 nm）、手术盘盖、遮光窗帘、微量移液器、紫外护目镜、防护手套.

1.2 菌株和试剂

菌株为大肠杆菌DH5α，为本实验室保存.LB 培养基：胰蛋白胨（10 g/L），酵母提取物（5 g/L），NaCl（10 g/L）；固体培养基加1%琼脂粉，灭菌后倒平板.生理盐水：0.9% NaCl.化学光 强 计 母 液A 液：Na2B4O7·10H2O 0.38g，KI 9.96 g，定容到50 mL；B 液：KIO32.14 g，定容到50 mL.

1.3 实验操作

（1）低压汞灯紫外光强的测量.方法根据文献［8］改编.取化学光强计母液A 液和B 液各2.5 mL 混合，加入敞口的培养皿（直径7 cm），置于低压汞灯垂直下方50 cm 处，用手术盘盖住.打开低压汞灯预热5 min，其间操作者戴好紫外护目镜和防护手套.揭开手术盘，同时计时光照.计时结束同时将手术盘盖上，关灯，取少量样品稀释10 倍后检测352 nm 吸光度变化.重复若干次，记录光照时间和352 nm吸光度，并作图分析计算光强.

（2）细菌培养和菌落计数.取冻存保种菌在LB 固体培养基平板进行划线培养，37 ℃培养过夜，长出单菌落后，从平板上挑取一个单菌落接于2 mL LB 液体培养基的试管中，37 ℃振荡培养过夜.取培养好的菌液，用生理盐水稀释100 倍，然后以10 倍梯度连续稀释至10-7倍.取不同稀释梯度的菌液100 μL 分别在LB固体培养基涂板，同时在LB 固体培养基上按照浓度梯度取5 μL 菌液点板，37 ℃避光培养，隔日对平板上菌落进行计数.做三次平行实验.

（3）细菌的紫外损伤和光修复实验.将实验室的遮光窗帘拉上，创造一个暗环境，照明采用红色LED 光源，防止不必要的光修复.取100 μL 菌液置于剪下的灭菌EP 管盖中并将其置于低压汞灯垂直下方50 cm 处，用手术盘盖住.打开低压汞灯预热5 min，其间操作者戴好紫外护目镜和防护手套.揭开手术盘同时光照并计时，计时结束同时将手术盘盖上，关灯.将菌液用生理盐水按不同浓度梯度稀释后分别涂板和点板培养，隔日对平板上菌落进行计数.将紫外照射的菌液在暗处孵育10 min 后放置于白色LED 灯垂直下方10 cm处，用手术盘盖住.打开白色LED 灯，揭开手术盘，同时计时光照.计时结束同时将手术盘盖上，关灯.将菌液用生理盐水按不同浓度梯度稀释后分别涂板和点板，37 ℃避光培养，隔日对平板上菌落进行计数.做三次平行实验.

将紫外照射后部分损伤的菌液放在暗处孵育0 min、5 min、10 min、20 min、40 min 后开始白色LED 光照并计时，取样后用生理盐水按不同浓度梯度稀释后点板37 ℃避光培养，隔日对平板上菌落进行计数.做三次平行实验，探究暗处孵育对紫外损伤后的菌液光修复的影响.

2 结果

2.1 化学光强计测量紫外光强

碘化钾—碘酸钾化学光强计的原理是碘化钾和碘酸钾在光子的催化下，生成I3，产物在352 nm 具有吸收峰，消光系数为27 600 L/（mol·cm），量子产率为0.73.测量紫外吸收光谱时取少量样品稀释10 倍测量.根据测量结果作图分析，计算出紫外光强（图1）.

图1 碘化钾-碘酸钾化学光强计测量结果

从图1 可以看出，取352 nm 处的吸光度对紫外光照时间作图后，经线性拟合R2=0.987，斜率0.068 6，表明紫外光强约为2.11 W/m2.

计算得到352 nm处I3的生成速率为0.119 6，因 此I3的 摩 尔 数=0.005×A352nm/27 600，其 中0.005 是样品体积（5 mL）除以1 升（1 000 mL）的体积的比值，27 600 是摩尔消光系数.通过光强计算公式I=Nhv/St计算可得本次实验的光强=2.11 W/m2.其中：v表示光的频率，S为照射区域面积，N为时间间隔t内照到S上的光子总数，h是普朗克常数.

2.2 细菌的菌落计数——涂板法和点板法的比较

涂板法和点板法所得到的菌落数接近，但点板法和涂板法相比较，所用的培养皿、实验耗材相对较少，所耗时间也比较少，细菌存活率变化更加直观，因此我们在后续的试验中均采用点板法进行.

2.3 细菌的紫外存活率和光修复效率的测定

将紫外照射后的菌液梯度稀释进行点板培养，隔日进行菌落计数.按照同样的方法将紫外照射后的菌液置于白色LED 灯下进行光修复.通过作图测定出细菌的紫外存活率和白光的修复效率.DH5α 紫外光照后的计数结果及DH5α 光修复后的计数结果分别如图2和图3 所示.

图2 DH5α 紫外光照后计数结果

图3 DH5α 光修复后计数结果

3 讨论与结论

低压汞灯又名紫外灭菌灯，其发射波长为254 nm，正好位于DNA 和蛋白质吸收峰附近，容易造成DNA 等生物大分子损伤.低波长紫外线可引起DNA 同一条链上相邻的嘧啶碱基形成二聚体结构（TT），导致DNA 的双螺旋结构发生改变，使复制与转录过程受阻，从而抑制细菌生长或杀死细菌［9］.在大肠杆菌（DH5α）中存在一种DNA 光修复酶（DNA photolyase），能够识别并结合损伤的嘧啶二聚体，在可见光（400 nm）激发下，修复紫外造成的DNA 损伤［10-11］.市面的紫外光强计昂贵且准确度低，不适用于本科实验教学.在紫外损伤细菌实验中，我们采用了碘化钾—碘酸钾化学光强计进行紫外光强的间接测量，科学合理地测量出不同规格的低压汞灯的紫外剂量，与传统的草酸铁钾光强计［12］相比，其在紫外区准确度更高，且对可见光不敏感，学生能够高效简便地重复实验.

细菌涂板计数法虽然灵敏度高，结果较为准确，但是存在可计数浓度范围窄、计数准确度低、涂布不均和计数工作量大等问题，容易造成较大的实验误差.与涂板计数法［13］相比，点板法具有所需样品量少、点样区域小，检测范围广，计数简便等优点.这种方法不仅可以直观地反映不同浓度下菌落数的变化，而且可以降低实验成本，提高实验效率.为了让学生更直观地了解光修复的原理，采用点板法设计细菌紫外损伤和光修复实验更加合理.在一定范围内，细菌经过紫外损伤后菌落数逐渐减少，光修复实验后菌落数逐渐增加，在同一块培养皿上可以直观地看出这种变化.此外，在实验过程中我们采用红色LED 光源照明，波长（635 nm）较为单一，可以有效防止照明光源对细菌的光修复.

一定量的紫外线照射后的大肠杆菌黑暗条件下被保存在缓冲液或盐水中时，能够在复杂培养基上形成菌落的细胞数量逐渐增加［14-15］，这被称为液体复苏持有（Liquid holding recovery，LHR）.紫外照射后在黑暗处保存不同的时间开始计时光照，取样点板，结果显示，短暂的暗处孵育对细菌的光修复影响并不明显，考虑到光修复酶与DNA 损伤识别、结合需要一定的时间［16］，实验采用紫外照射后10 min 开始光照以达到预期实验结果.结果表明，细菌光修复实验的设计和改进科学合理，但存在一定的局限性，细菌的种属、生长状态等因素对实验结果有一定的影响，光修复酶的具体作用分子机制尚不清楚，后期将进一步开展不同菌种、实验条件的细菌光修复实验，奠定DNA 损伤和修复实验教学基础.