LC-MS/MS法测定跌打酒中9种成分及主成分分析

蓝晓庆，韦瑀龙，陆兰娟

0 引言

跌打酒是广西中医药大学附属瑞康医院的院内制剂，由制马钱子、大黄、三七、续断、乳香、没药、苏木、泽兰、土鳖虫、自然铜、无名异等十多味中药所组成，具有活血止痛，通络化瘀的功效，临床观察研究表明[1-3]，该药用于跌打损伤，关节疼痛，四肢麻木等症疗效显著。方中马钱子通络止痛，散结消肿，具有镇痛、促进骨折愈合、修复软骨损伤和抗骨质增生的药理作用[4]；大黄凉血解毒，逐瘀通经，《神农本草经》有言：本品主下瘀血、血闭、寒热、破癥瘕积聚；三七散瘀止血，消肿定痛，以上三者均为跌打损伤的常用要药。

本研究尝试采用液质联用色谱法在同一色谱质谱条件下测定跌打酒中来源于马钱子(马钱子碱和士的宁)、大黄(大黄酸、大黄酚、大黄素和大黄素甲醚)和三七(三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1)的9种成分，并进行主成分分析，经查阅文献未见有上述9个成分同时测定方法的报道，本方法的开发建立可为跌打酒或类似制剂的质量控制和评价提供参考。

1 仪器与试药

超声波清洗机(VGT-2227QTD，广东固特超声股份有限公司)，电子分析天平(GR-202，日本)，高效液相色谱-串联质谱仪(LC-MS TripleQuad 3500)；马钱子碱(批号：MUST-17041906)、士的宁(批号：MUST-17053001)对照品购于成都曼思特生物科技有限公司；大黄酸(批号：0757-200206)、大黄酚(批号：110796-200412)、大黄素(批号：110756-200110)、大黄素甲醚(批号：110704-200420)、三七皂苷R1(批号：110745-200415)、人参皂苷Rb1(批号：110704-200420)、人参皂苷Rg1(批号：110703-201731)对照品购于中国食品药品检定研究院，甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件 色谱条件：色谱柱kinetex C18(50 mm × 3 mm，2.6 μm)；流动相为0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～1.0 min,90.0%A;1.0～1.5 min,90.0%～80.0%A;1.5～5.0 min,80.0%～55.0%A;5.0～7.0 min,55.0%～8.0%A;7.0～9.0 min,8.0%A;9.0～9.1 min,8.0%～90.0%A;9.1～11.0 min,90.0%A)；流速0.35 ml/min，柱温35 ℃；进样量10 μl。质谱条件：离子源为ESI；检测模式：正、负离子模式；扫描方式：多反应监测(MRM)；喷雾电压：5 500 V；离子源温度：500.0 ℃。质谱参数见表1。

表1 9种成分的质谱参数[5-7]

图1 9种成分的提取离子流色谱图

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1 精密称取马钱子碱、士的宁、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1对照品适量，分别置10 ml量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，分别得到浓度为1.0 mg/ml的对照品贮备液。再分别精密量取对照品贮备液适量，以甲醇依次稀释成浓度为100 μg/ml，10 μg/ml，1 μg/ml的对照品溶液。

2.2.2 精密吸取马钱子碱、士的宁、三七皂苷R1对照品溶液适量至25 ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，得含马钱子碱、士的宁、三七皂苷R1均为1 μg/ml的混合对照品溶液A。

2.2.3 精密吸取大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1对照品溶液适量至25 ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，得含大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1均为1 μg/ml的混合对照品溶液B。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚供试品溶液 精密量取跌打酒1.0 ml，至50 ml量瓶中，加甲醇-水(1∶1)稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.2 马钱子碱、士的宁、三七皂苷R1供试品溶液 精密量取“2.3.1”项的供试品溶液10.0 ml，至50 ml量瓶中，加甲醇-水(1∶1)稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1供试品溶液 精密量取“2.3.1”项的供试品溶液1.0 ml，至50 ml量瓶中，加甲醇-水(1∶1)稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 线性关系 精密吸取混合对照品溶液A适量，甲醇-水(1∶1)稀释成对照品浓度为80、100、150、200、400、600、800 ng/ml系列梯度，在“2.1”项下条件下进样测定；精密吸取混合对照品溶液B适量，甲醇-水(1∶1)稀释成对照品浓度为20、50、80、100、150、200、400 ng/ml系列梯度，在“2.1”项下条件下进样测定。上述测定结果以浓度(ng/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，结果见表2。

表2 各成分的线性回归方程

2.5 重复性试验 取同一批样品，按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液6份，进样，测峰面积，结果见表3。

2.6 精密度试验 取混合对照品溶液A、B，分别连续进样6次，测定峰面积，结果见表3。

2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、3、6、9、12 h进样，测定峰面积，结果见表3。

表3 重复性、精密度、稳定性试验结果

结果表明，测定方法的重复性和仪器精密度良好，且供试品溶液在12 h内是稳定的。

2.8 加样回收率试验 精密吸取同一已知含量的样品0.5 ml，按表4供试品溶液制备方法分别制备各成分加样回收试验用供试品溶液，在“2.1”项条件下进样测定，计算回收率及RSD值，结果见表5。

表4 加样回收供试液制备

表5 加样回收试验结果

2.9 样品测定

取10批跌打酒样品，按“2.3”项下方法分别平行制备供试品2份，在“2.1”项下条件进样测定，计算各成分含量，结果见表6。

表6 10批样品的测定结果(μg/ml)

2.10 主成分分析 以SPSS 19.0 对上述测定的9个成分进行主成分分析，计算其特征值和方差贡献率，以特征值>1为标准，得出前三个主成分因子特征值分别为4.125、2.435、1.280，是评价跌打酒质量的主要影响因子，三个主成分因子的方差贡献率为87.106%，结果见表7。

表7 主成分因子的特征值及方差贡献率

表8 旋转后的主因子载荷矩阵表

表9 10批样品的主成分因子综合得分及排序

3 讨论

中药制剂尤其是复方制剂成分复杂，采用单一成分的含量评价制剂质量有所欠缺，而采用高效液相色谱法测定多个成分虽较易于普及，但耗时较长，且部分成分因结构性质差异较大，在同一色谱条件下的分离度不甚理想，而液质联用色谱法能进一步通过提取相应成分的特征离子流，所以其定性与定量受样品色谱分离度的影响不大。

前期试验考察以0.1%甲酸水溶液-甲醇为流动相，人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1色谱峰响应低、干扰大，改成0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液-甲醇后，不仅能有效改善人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1色谱行为，同时不影响其他成分的检测。

从主成分分析结果来看，测定的10批样品中，前期生产的6个批次中部分成分含量的批间波动较大，而后期生产的4个批次(即20171121、20180228、20180825、20190114)批间成分含量差异小，且整体质量更好，这可能与近年来国家加强对中药饮片的监管有关，使得购进的原料质量有所保障，进而保证了产品质量。