木丹颗粒通过调控PI3K/AKT通路改善糖尿病大鼠神经病理性疼痛的研究

齐月，刘彦彤，张航，赵增杰

痛性糖尿病周围神经病变(painful diabetic periphe-ral neuropathy,PDPN)属于糖尿病引起周围神经功能障碍、神经电生理等指标异常以及相关临床症状的并发症，1型糖尿病患病率大约占5%，2型糖尿病患病率大约占20%[1]。临床上以自发性疼痛、接触性疼痛、痛觉过敏等症状为主，严重影响患者睡眠、情绪等生活质量。然而其发病机制尚不明确，认为与炎性反应、氧化应激、多元醇通路激活、代谢紊乱、糖基化终产物堆积等有关[2]。目前对于PDPN治疗比较棘手，主要采取控制血糖、改善微循环、营养神经、抗氧化应激、改善代谢、止痛等手段来缓解症状，而尚无有效方法来逆转PDPN的进展,因此其治疗成为一大难题[3]。中药复方木丹颗粒具有益气活血、通络止痛功效，是临床上第一个治疗糖尿病周围神经病变疗效明确的创新性中成药，充分发挥中医药多靶向、多途径性作用，目前已经写入中医治疗PDPN临床路径之中[4]。现观察木丹颗粒是否通过PI3K/AKT信号通路发挥对PDPN调控作用的，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验动物：健康SPF级Wistar雄性大鼠90只，8周龄，平均体质量(180.0±23.5)g，购自辽宁长生生物技术有限公司[合格证号：SCXK(辽)2013]，饲养于辽宁中医药大学动物实验中心，室温(21±3)℃，相对湿度(55～65)%，噪音<60 dB，分笼饲养，每笼5只，每日光照12 h，通风良好，普通饲料喂养，自由进食水。(2)药物与试剂：木丹颗粒(营口奥达制药有限公司生产)；甲钴胺片(北京星昊医药股份有限公司生产)；链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司生产，采购于沈阳市皇姑区普祥生物试剂经销处)；PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司生产)；PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT一抗和二抗(湖北雪瑾生物技术有限公司生产)。(3)仪器设备：血糖仪(美国强生)，Vonfrey仪(上海玉研科学仪器有限公司)，酶标仪(Thermo-Fisher)，离心机(Thermo-Fisher)，电泳仪(biorad)，凝胶成像仪(biorad)，定量PCR仪(biorad)。

1.2 实验方法 2018年11月—2019年4月在辽宁中医药大学实验中心进行实验。

1.2.1 造模与分组：将雄性Wistar大鼠90只适应喂养7 d后，随机选取12只为正常组(CON组)，其余78只大鼠进行造模，正常组将等体积的0.1 mol/L枸橼酸盐缓冲液单次腹腔注射，造模大鼠按STZ 53 mg/kg一次性腹腔注射，继续喂养72 h后测定大鼠尾静脉血糖，血糖>16.7 mmol/L者列为观察对象，14日后测机械性痛阈及神经传导速度，明显下降者为PDPN造模成功(在实验过程中糖尿病造模失败5只，PDPN造模失败13只)。再根据随机数字表法将成模大鼠60只随机分为5组：模型组(MOD)、木丹颗粒低剂量组(MD-L)、木丹颗粒中剂量组(MD-M)、木丹颗粒高剂量组(MD-H)、甲钴胺组(JGA)，每组12只。

1.2.2 实验给药：大鼠灌胃给药剂量参照《动物实验方法学》[5]，按照成人每日中药用量与体质量折算系数的 6.25 倍计算药量。木丹颗粒低剂量组剂量为1.615 g·kg-1·d-1，中剂量组剂量为3.231 g·kg-1·d-1，高剂量组剂量为6.462 g·kg-1·d-1，甲钴胺组剂量为0.231 mg·kg-1·d-1，上述药物均用蒸馏水配制，浓度保证大鼠灌胃体积为1 ml/100g，每次配制200 ml,放置在4℃保存；模型组和正常组按等容积蒸馏水灌胃。以上6组均从成模后开始每日固定时间灌胃给药1次，连续8周实验结束。实验期间大鼠予普通饲料喂养，自由进食和饮水。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 体质量及血糖测定：于给药前及给药后2 w、4 w、8 w称大鼠体质量，并采用强生血糖仪测定尾静脉血糖，采血针浅刺大鼠尾部下1/3处尾部静脉， 使血液充分滴入血糖试纸中，按照血糖仪显示数值记录血糖。

1.3.2 机械痛阈测定[6]：于给药前及给药后2 w、4 w、8 w采用标准化Vonfrey仪测定各组大鼠后足的机械缩足反应阈值(MWT)：将大鼠置于金属网架上的透明有机玻璃盒内，让大鼠适应环境至少15 min，待大鼠的梳理和探究等活动基本消失，安静并出现洗脸、梳理毛发等活动后，用电子Vonfrey仪的探头纤维垂直剌激大鼠后肢足底中部，以大鼠在刺激后出现快速的缩足反应为阳性反应，记录此时的受力数值(g)；每只大鼠每侧足底测量3次，每一次测量后，待大鼠适应环境3～5 min后再次测量。因身体活动所引起的缩足反应不记作阳性反应。

1.3.3 神经传导速度测定[7]：于给药前及给药后2 w、4 w、8 w检测大鼠坐骨神经传导速度。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，固定成仰卧位，分离大鼠坐骨神经，将刺激电极一端放在坐骨神经干，而另一端放在神经干腓支起始处，记录两电极之间的距离D(mm)和动作电位，刺激强度由小到强，分别计算2个点刺激产生动作电位的潜伏期T1和T2(ms)，记录测定的肌电图，按照传导速度计算公式为：V(m/s)=D(mm)/(T1-T2)(ms)，记录结果。

1.3.4 大鼠PI3K和AKT基因、蛋白表达水平测定：于用药后8 w末各组随机取8只大鼠，用20%乌拉坦( 0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，固定俯卧位，迅速取大鼠脊髓组织1 cm×0.15 cm 和L2～5背根神经节，置入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱中。

1.3.4.1 PI3K和AKT基因表达 (1)总RNA的提取:按照Trizol 法提取L4～5背根神经节和脊髓总RNA。(2)cDNA 模板的制备:分别取RNA 1μg按照M-MLV 逆转录酶说明书反转录成cDNA，稀释cDNA原液以作为cDNA工作液。(3)定量PCR: 以反转录所得cDNA为模板进行PCR扩增反应，用 Primer Premier 5.0软件设计引物，β-actin内参照253 bp，G1: 5＇-GCCTCGCTGTCCACC TTCCA-3＇，G2:5＇-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3＇；PI3K 扩增产物377 bp，上游引物: 5＇-CATCACTTCCTCCTGCTCTAT-3＇，下游引物: 5＇-CAGTTGTTGGCAATCTTCTTC-3＇；Akt 扩增产物121 bp，上游引物: 5＇-GGACAACCGCCATCCAGA CT-3＇，下游引物: 5＇-GCCAGGGACACCTCCATCTC-3＇，采用 PE9600定量PCR仪进行mRNA水平检测。PCR反应体系为20 μl，PCR扩增反应条件为: 95℃预变性5 min; 94℃变性30 s，55℃ 30 s，45个循环, 72℃延伸7 min。

1.3.4.2 PI3K和AKT蛋白水平 (1)提取组织蛋白：取冻存的L 2～3背根神经节和脊髓组织，充分研碎，加入蛋白裂解液，再转移到EP管，放置冰上；每5 min振荡1次，振荡6次，使组织充分裂解，收集悬液，12 000 r/min 4℃ 离心15 min，收集上清，转移分装到另一个EP管，保存在-80℃待用。(2)BCA法测定提取蛋白浓度：用蒸馏水稀释蛋白样品，取适量BCA试剂盒A液和B液，按50∶1混匀成工作液，将反应后的蛋白溶液，加入到孔板中，振荡30 s，测定吸光度，计算蛋白浓度，同时将样品蛋白保存在-80℃待用。(3)Western blot：制备聚丙烯酰胺凝胶，取样品蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，转移到PVDF膜上，室温封闭1 h，加入一抗(1∶1 000)孵育，4℃过夜，TTBS洗膜，加入二抗(1∶2 000)孵育1 h，蛋白质免疫检测，化学发光增强剂显色，用凝胶成像仪扫描，以目的蛋白与β-actin的灰度比值作为内参，分析并读取蛋白条带灰度值。

2 结 果

2.1 各组大鼠给药前后体质量比较 与CON组比较,MOD组在给药2 w、4 w、8 w后体质量均明显减轻，差异有统计学意义(P<0.01)；与MOD组比较,MD-L、MD-M、MD-H组大鼠在给药2 w、4 w、8 w后体质量均有不同程度增加,其中各组在给药4 w、8 w后差异有统计学意义(P<0.01)；与MD-L组比较,同期MD-M、MD-H组大鼠在给药2 w、4 w、8 w后体质量有不同程度增加,其中MD-H组给药4 w、8 w后体质量差异有统计学意义(P<0.05)；与MD-M组比较， MD-H组在给药8 w后体质量增加(P<0.05)；与MD-H组比较，JGA组在给药4 w、8 w后体质量下降(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠给药前后体质量比较

2.2 各组大鼠给药前后血糖比较 与CON组比较,MOD组在给药2 w、4 w、8 w后血糖均明显升高(P<0.01)；与MOD组比较,同期MD-L、MD-M、MD-H组在给药2 w、4 w、8 w后血糖不同程度降低,其中MD-H组在给药4 w、8 w后具有显著性差异(P<0.01)；与MD-L组比较,同期MD-M、MD-H组在给药4 w、8 w后血糖有不同程度降低,其中MD-H组给药4 w、8 w后血糖有差异(P<0.05或P<0.01)，与MD-M组大鼠比较,MD-H组在给药4 w、8 w后有差异(P<0.05),与MD-H组大鼠比较,JGA组在给药4 w、8 w后有差异(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠给药前后血糖比较

2.3 各组大鼠给药前后机械痛阈比较 与CON组比较,MOD组给药2 w、4 w、8 w后机械痛阈敏感性明显下降(P<0.01)；与MOD组比较,同期MD-L、MD-M、MD-H组及JGA组在给药2 w、4 w、8 w后机械痛阈敏感性均有不同程度升高,在4 w和8 w差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与MD-L组比较,同期MD-H量组在给药8 w后升高(P<0.05)，其余无差异(P>0.05)；与MD-M组比较,MD-H组在给药8 w差异具有统计学意义(P<0.05),与MD-H组比较,JGA组在给药4 w、8 w后无差异(P>0.05)，见表3。

表3 各组大鼠给药前后机械痛阈比较

2.4 各组大鼠给药前后坐骨神经传导速度比较 与CON组比较,同期MOD给药2 w、4 w、8 w后坐骨神经传导速度均明显减慢(P<0.01)；与MOD组比较,同期MD-L、MD-M、MD-H组及JGA组在给药2 w、4 w、8 w后坐骨神经传导速度均有不同程度加快,其中MD-L组在给药8 w后，MD-M、MD-H组及JGA组在给药4 w、8 w后有差异(P<0.05或P<0.01)；与MD-L组比较,同期MD-M、MD-H组及JGA组在给药4 w、8 w后有差异(P<0.05或P<0.01)；与MD-M组比较，同期MD-H组及JGA组在给药2 w、4 w、8 w后无差异(P>0.05)；与MD-H组比较，同期JGA组在给药2w、4w、8w后无差异(P>0.05)，见表4。

表4 各组大鼠给药前后坐骨神经传导速度比较

2.5 各组大鼠PI3K和AKT基因的表达水平 给药8周后，与CON组比较，MOD组PI3K和AKT mRNA 表达均降低(P<0.01)；与MOD组比较，MD-L、MD-M、MD-H组及JGA组PI3K和AKT mRNA 表达均有升高(P<0.05或P<0.01 )；与MD-L组比较,MD-M、MD-H组及JGA组PI3K和AKT mRNA 表达均升高(P<0.05或P<0.01)；与MD-M组比较，MD高剂量组及JGA组PI3K和AKT mRNA 表达均升高(P<0.05)；与MD-H组比较，JGA组PI3K和AKT mRNA 表达无差异(P>0.05)，见表5。

表5 各组大鼠PI3K、AKI基因表达量比较

2.6 各组大鼠PI3K/AKT蛋白水平比较 与CON组比较，MOD组PI3K、AKT蛋白表达显著降低(P<0.01)；与MOD组比较，MD-M、MD-H组及JGA组均明显增高(P<0.01 或P<0.05)，见图1。

注：A.CON组；B.MOD组；C.JGA组;D.MD-L组；E.MD-M组；F.MD-H组

3 讨 论

目前，糖尿病发病率逐年升高，中国民众患病率约10.9%，到2035年预计将增加到5.92亿，可以累及心、脑、肾、血管、神经等，已经成为危害人体健康的世界性代谢疾病之一[8]。同时，糖尿病神经系统并发症的患病率也呈逐渐上升趋势，其中痛性糖尿病周围神经病变是临床上最为常见的神经并发症之一，约有25%糖尿病患者会存在PDPN，主要表现为肢体或躯干灼热痛、刺痛，甚至难治性疼痛，严重影响糖尿病患者生活和工作质量。

现代医学对PDPN发病机制尚未完全阐明，目前PI3K/AKT信号通路在其发病过程的作用引起人们越来越多的关注。PI3K/AKT 信号通路是细胞内外信息传递和应答的桥梁，激活后可以参与多个疾病的生理和病理过程[9]。PI3K/AKT 信号通路是胰岛素重要的下游信号传导途径，胰岛素发挥生物效应离不开 PI3K/AKT 信号通路的正常转导，因此PI3K/AKT 信号通路具有调节血糖的功能[10-11]。研究证实，PI3K/AKT 信号通路在糖尿病状态下会受到抑制。本研究结果证实，MOD组大鼠处于持续高血糖状态，PI3K和AKT表达量明显降低，而木丹颗粒各组PI3K和AKT表达量升高，血糖也有所降低，在一定程度上提示木丹颗粒可能通过激活PI3K/AKT信号通路来降低PDPN大鼠血糖。

PI3K/AKT信号通路是调控细胞周期的经典通路之一，参与神经元细胞生长、分化、增殖等一系列细胞功能，在细胞存活及凋亡中起着关键作用。有研究发现，PI3K/AKT通路在糖尿病和神经系统疾病中扮演着各种重要角色[12]，被认为是诱发和维持神经性疼痛的关键因素[13]，该通路在糖尿病性神经元中被抑制，如果此通路被激活，会减弱高血糖诱导的神经元凋亡[14]，缓解神经痛。本研究结果显示，MOD组大鼠机械性痛阈和神经传导速度延长，而木丹颗粒各组大鼠痛阈提高、神经传导速度加快，由此说明PI3K/AKT信号通路激活在PDPN神经电生理的改变上起到了一定作用。

对于PDPN，西医治疗除了控制血糖、改善微循环、抗氧化、镇痛、抗抑郁外，并无理想药物[15]，往往是治标不治本，治疗后极易复发。因此，单纯依靠现代医学治疗方法存在局限性，应充分发挥中医药优势，中西医结合治疗是必要的。PDPN属于中医“消渴病痹症”范畴，辨证多认为由气虚血瘀所致，而木丹颗粒是益气活血、通络止痛的代表性药物。既往研究表明，木丹颗粒可以加快神经传导速度，减少细胞凋亡，降低氧化应激和炎性反应，改善糖脂代谢，改变血液流变学障碍等[16-20]。

本实验应用木丹颗粒干预PDPN大鼠模型，结果表明，与CON组比较，MOD组大鼠背根神经节PI3K和AKT mRNA和蛋白表达均降低。说明MOD组PDPN大鼠PI3K/AKT信号通路被激活引起组织损伤。木丹颗粒干预后，明显升高神经组织PI3K和AKT mRNA含量，使PI3K和AKT蛋白表达升高，减轻神经组织的炎性损伤，而且效果呈剂量相关性，随着木丹颗粒的剂量增加而更明显，木丹颗粒中、高剂量组与JGA组效果相当。

总之，本研究通过木丹颗粒对痛性糖尿病周围神经病变大鼠PI3K/AKT 信号通路的影响，推测木丹颗粒可能通过上调 PI3K/AKT 信号通路相关蛋白的表达，减轻胰岛素抵抗，增加胰岛素的敏感性，减少神经组织细胞凋亡，发挥缓解糖尿病神经病理性疼痛作用。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

齐月：设计研究方案，论文撰写；刘彦彤、张航：实施研究过程，资料搜集整理；赵增杰：进行统计分析