洛神花总黄酮提取工艺及其稳定性研究

黄 琼，谢向机，林嘉丽，陈 楠

（1.福建农业职业技术学院，福建 福州 350003；2.三明市产品质量监督检验所，福建 三明 365000）

洛神花又名玫瑰茄、山茄、洛神葵等[1]，是锦葵科木槿属的一年生草本植物[2]。洛神花花萼含有丰富的有机酸、碳水化合物、粗蛋白、粗脂肪和总黄酮等物质[3]，其中总黄酮具有消炎、抑菌、抗氧化、抗肿瘤等生理作用[4]。目前，洛神花的栽培技术及化学成分研究报道较多[5-6]，但尚未见洛神花总黄酮提取及其稳定性的研究报道。总黄酮提取方法有乙醇热浸提[7]、微波提取[8]、超声波提取[9]、超临界萃取[10]、超声波微波协同萃取[11]等，其中超声波提取具有提取效率高、缩短提取时间等优点。本研究采用超声波提取洛神花总黄酮，响应面法优化提取工艺条件，同时考察光照、温度、pH、常见金属离子对洛神花总黄酮稳定性的影响，以期为洛神花总黄酮的进一步纯化和活性研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

洛神花为市售；芦丁标准品（纯度≥98%），中国药品生物制品检定所产品；无水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、KCl、NaCl 等化学试剂，均为国产分析纯。

1.1.2 仪器与设备

ME204 梅特勒电子天平，UV-1800-DS2 型紫外可见分光光度计，FZ102 微型植物粉碎机，LGR10-4.2型高速冷冻离心机，KQ-500DE 型数控超声波清洗器。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

洛神花花萼→清洗→55 ℃烘干→粉碎→过筛→超声波辅助提取→离心→取上清液→定容→样品提取液

1.2.2 洛神花总黄酮含量的测定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 方法[12]，测定波长510 nm，绘制芦丁标准曲线，得回归方程为：C=0.1025A-0.000 51，R2=0.999 9，式中：C为芦丁质量浓度，mg/mL；A为吸光度。表明芦丁质量浓度在0～5.0 mg/mL 范围内与吸光度呈现良好的线性关系。根据标准曲线回归方程计算出洛神花总黄酮含量。

洛神花总黄酮含量（mg/g）=提取液中总黄酮质量（mg）/样品质量（g）

1.2.3 洛神花总黄酮得率的计算

准确移取1.0 mL 样品提取液置于50 mL 容量瓶并用70%乙醇定容，摇匀，即得稀释50 倍的样品溶液。量取1.0 mL 稀释液置于25 mL 容量瓶中，按绘制标准曲线的步骤，测定样品吸光度，得样品总黄酮质量浓度，并按下列公式计算洛神花总黄酮得率。

式中：C为样品提取液总黄酮质量浓度，mg/mL；V为样品提取液体积，mL；N为稀释倍数；M为样品干粉质量，mg。

1.2.4 单因素试验设计

1.2.4.1 乙醇浓度对洛神花总黄酮得率的影响

设置提取温度40 ℃，液固比20∶1（mL/g），提取时间20 min，超声波功率200 W，乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%，考察乙醇浓度对洛神花总黄酮得率的影响。

1.2.4.2 液固比对洛神花总黄酮得率的影响

设置乙醇浓度60%，提取温度40 ℃，提取时间20 min，超声波功率200 W，液固比分别为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g），考察液固比对洛神花总黄酮得率的影响。

1.2.4.3 提取温度对洛神花总黄酮得率的影响

设置乙醇浓度60%，液固比50∶1（mL/g），提取时间20 min，超声波功率200 W，提取温度分别为40、50、60、70、80 ℃，考察提取温度对洛神花总黄酮得率的影响。

1.2.4.4 提取时间对洛神花总黄酮得率的影响

设置乙醇浓度60%，液固比50∶1（mL/g），提取温度60 ℃，超声波功率200 W，提取时间分别为20、30、40、50、60 min，考察提取时间对洛神花总黄酮得率的影响。

1.2.4.5 超声波功率对洛神花总黄酮得率的影响

设置乙醇浓度60%，液固比50∶1（mL/g），提取温度60 ℃，提取时间50 min，超声波功率分别为200、250、300、350、400 W，考察超声波功率对洛神花总黄酮得率的影响。

1.2.5 响应面优化试验设计

采用Box-Behnken 模型，对影响洛神花总黄酮得率的3 个关键因素（液固比、提取温度、提取时间）进行优化设计，响应面试验因素水平详见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.6 洛神花总黄酮稳定性试验

1.2.6.1 温度对洛神花总黄酮稳定性的影响

取7 份洛神花总黄酮提取液10.0 mL，分别置于30、40、50、60、70、80、90 ℃水浴60 min，取出后冷却至室温，测定洛神花总黄酮含量。

1.2.6.2 光照对洛神花总黄酮稳定性的影响

取3 份洛神花总黄酮提取液50.0 mL，分别在室外自然光、室内自然光和室内避光保存0、1、2、3、4、5、6、7 d，测定洛神花总黄酮含量。

1.2.6.3 pH 对洛神花总黄酮稳定性的影响

取10.0 mL 洛神花总黄酮提取液共12 份，调节其pH 分 别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，静置60 min，测定洛神花总黄酮含量。

1.2.6.4 常见金属离子对洛神花总黄酮稳定性的影响

取洛神花总黄酮提取液10.0 mL 共9 份，分别加入浓度为0.1 mol/L 的KCl、NaCl、ZnSO4、CuSO4、CaSO4、Al2(SO4)3、FeSO4、NiSO4、MgCl2金属离子溶液0.10 mL，静置60 min，测定洛神花总黄酮含量，并作空白对照。

1.2.7 数据处理

每组试验均重复3 次，结果取平均值。单因素显著性分析利用SPSS22.0 软件，响应面设计及优化分析利用Design-Expert 8.0.5 软件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对洛神花总黄酮得率的影响

如图1 所示，洛神花总黄酮得率随着乙醇浓度的增大先升高后降低，乙醇浓度为60%时，总黄酮得率最大。原因可能是乙醇浓度越高，越有利于总黄酮溶出，但乙醇浓度过高，醇溶性杂质溶出量增多，与总黄酮争夺溶剂，降低总黄酮得率。因此，乙醇浓度选定为60%。

图1 乙醇浓度对洛神花总黄酮得率的影响Fig.1 Effects of ethanol concentrations on total flavonoids yields of roselle

2.1.2 液固比对洛神花总黄酮得率的影响

如图2 可见，洛神花总黄酮得率随着液固比的增大先升高后降低，液固比为50∶1（mL/g）时，总黄酮得率最大。原因可能是液固比越大，传质推动力越强，总黄酮提取越彻底，但液固比过高会削弱超声波的辅助作用，影响总黄酮的溶出，降低总黄酮得率。因此，选定液固比为50∶1（mL/g）。

图2 液固比对洛神花总黄酮得率的影响Fig.2 Effects of liquid-material ratios on total flavonoids yields of roselle

2.1.3 提取温度对洛神花总黄酮得率的影响

如图3 所示，洛神花总黄酮得率随着提取温度的升高先增加后减少，提取温度为60 ℃时，总黄酮得率最大。原因可能是总黄酮在高温下易被破坏，同时增大杂质的溶出，对后续的操作造成一定的影响。因此，选定提取温度为60 ℃。

图3 提取温度对洛神花总黄酮得率的影响Fig.3 Effects of extraction temperatures on total flavonoids yields of roselle

2.1.4 提取时间对洛神花总黄酮得率的影响

如图4 可示，洛神花总黄酮得率随着提取时间的延长先增加后减少，提取时间为50 min 时，总黄酮得率最大。原因可能是提取时间短，总黄酮还未完全溶出，但提取时间太长，导致总黄酮被分解，降低总黄酮得率。因此，选定提取时间为50 min。

图4 提取时间对洛神花总黄酮得率的影响Fig.4 Effects of extraction time on total flavonoids yields of roselle

2.1.5 超声波功率对洛神花总黄酮得率的影响

如图5 所示，洛神花总黄酮得率随着超声波功率的增大先增加后减少，超声波功率为350 W 时，总黄酮得率最大。原因可能是超声功率的增大有利于细胞内活性物质的释放，但一些能分解总黄酮的酶也被充分释放出来，导致总黄酮分解，降低总黄酮得率。因此，选定超声波功率为350 W。

图5 超声波功率对洛神花总黄酮得率的影响Fig.5 Effects of ultrasound powers on total flavonoids yields of roselle

2.2 洛神花总黄酮提取响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计与结果

综合单因素试验结果可知，液固比、提取温度和提取时间对洛神花总黄酮得率影响显著，乙醇浓度和超声波功率对得率的影响不显著。因此，选取对得率影响显著的液固比、提取温度、提取时间3 个因素进行响应面试验设计。采用Box-Behnken 模型优化设计提取工艺条件，响应面试验设计方案及结果见表2，回归方程方差分析见表3。

表2 Box-Behnken 设计方案及试验结果Table 2 Box-Behnken design and results

表3 回归方程的方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation

根据表2 结果进行多元回归拟合，得到二次多项回归方程式为：

由R2值可知该模型与实际试验误差较小。由表3 可见，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明此模型可以预测总黄酮最优提取工艺条件。A、B、AB、BC、A2、B2、C2对总黄酮得率影响极显著（P＜0.01），C、AC对总黄酮得率的影响不显著。3 个条件对洛神花总黄酮得率影响大小顺序为：A液固比＞B提取温度＞C提取时间。

2.2.2 各因素间的交互作用对洛神花总黄酮得率的影响

等高线变化越密集，该因素对响应值影响越大，根据图6～8 等高线疏密程度，得3 因素对洛神花总黄酮得率影响大小顺序为：A液固比＞B提取温度＞C提取时间，再次验证了表3 的分析结果。响应面曲线越陡，说明两者交互作用对响应值影响越显著，响应曲面越平滑，说明两者交互作用对响应值影响越不显著。根据图6～8，得液固比和提取温度及提取温度和提取时间的交互作用对洛神花总黄酮得率影响显著，而液固比和提取时间交互作用对洛神花总黄酮得率影响不显著，再次验证了表3 的分析结果。

图6 液固比和提取温度的交互作用对洛神花总黄酮得率影响的响应面和等高线图Fig.6 Contour plot and response surface showing the interactive effects of liquid-material ratios and extraction temperatures on total flavonoids yields of roselle

图7 液固比和提取时间的交互作用对洛神花总黄酮得率影响的响应面和等高线图Fig.7 Contour plot and response surface showing the interactive effects of liquid-material ratios and extraction time on total flavonoids yields of roselle

图8 提取温度和提取时间的交互作用对洛神花总黄酮得率影响的响应面和等高线图Fig.8 Contour plot and response surface showing the interactive effects of extraction temperatures and extraction time on total flavonoids yields of roselle

2.2.3 响应面试验模型的验证

根据响应面模型得到优化提取工艺条件为：液固比48.53∶1（mL/g），提取温度59.19 ℃，提取时间50.21 min，洛神花总黄酮得率理论值为3.71%。考虑到操作简便、实用，最终确定最优工艺条件为：液固比50∶1（mL/g），提取温度60 ℃，提取时间50 min。在此条件下总黄酮得率为3.69%，与理论值（3.71%）相对误差为0.54%。

2.3 洛神花总黄酮稳定性研究

2.3.1 温度对洛神花总黄酮稳定性的影响

如图9 所示，温度在30～60 ℃时，洛神花总黄酮含量随着温度的升高变化不大，说明洛神花总黄酮在30～60 ℃时稳定性好。但温度升高到60 ℃以上，其含量随温度升高而降低，原因是温度升高加快分子间运动，总黄酮氧化分解。因此，洛神花总黄酮生产和保存应在30～60 ℃环境中。

图9 不同温度下洛神花总黄酮含量的变化Fig.9 Effects of temperatures on stability of total roselle flavonoids

2.3.2 光照对洛神花总黄酮稳定性的影响

如图10 所示，室外自然光下保存时，随着保存时间的延长，洛神花总黄酮含量降低，原因是洛神花总黄酮对紫外线敏感，室外自然光照射会破坏总黄酮结构；而室内自然光对洛神花总黄酮稳定性影响较小，避光保存不影响其稳定性。因此，室外自然光会影响洛神花总黄酮稳定性，故长期保存应避光，短期保存可在室内自然光下。

2.3.3 pH 对洛神花总黄酮稳定性的影响

如图11 所示，pH 为1.0～3.0 及6.0～12.0 时，洛神花总黄酮含量降低，pH 为3.0～6.0 时，其含量基本稳定。原因是总黄酮苯环结构中含有酚羟基，显弱酸性，所以总黄酮在弱酸性的环境中比较稳定。因此，洛神花总黄酮在强酸强碱的环境中易受到破坏，适宜在弱酸性条件下保存使用。

图11 不同pH 下洛神花总黄酮含量的变化Fig.11 Effects of pH on stability of total roselle flavonoids

2.3.4 常见金属离子对洛神花总黄酮稳定性的影响

如图12 所示，同空白组相比较，K+、Na+、Zn2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+组洛神花总黄酮含量基本没有改变，说明K+、Na+、Zn2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+对其稳定性基本没有影响；但Al3+、Cu2+、Fe2+组洛神花总黄酮含量降低，且三者的影响大小表现为：Fe2+＞Al3+＞Cu2+，原因是Al3+与总黄酮中的酚羟基形成络合物，Fe2+、Cu2+与提取液的邻二酚羟基反应生成不溶性络合物。因此，洛神花总黄酮储存和食品加工中应避开Al3+、Cu2+、Fe2+金属离子。

图12 不同金属离子条件下洛神花总黄酮含量的变化Fig.12 Effects of metal ions on stability of total roselle flavonoids

3 结论

（1）采用Box-Behnken 响应面试验设计法研究超声波提取洛神花总黄酮最佳工艺条件的结果表明，影响洛神花总黄酮得率因素大小顺序为：液固比＞提取温度＞提取时间，最佳工艺条件为：乙醇浓度60%，液固比50∶1（mL/g），提取温度60 ℃，提取时间50 min，超声波功率350 W，在此条件下，洛神花总黄酮得率为3.69%，与理论值（3.71%）相对误差为0.54%。

（2）洛神花总黄酮稳定性试验结果表明，洛神花总黄酮在30～60 ℃下比较稳定，在pH 3.0～6.0 下最稳定，室外强光和金属离子Cu2+、Fe2+、Al3+对其稳定性影响较大。因此，应在弱酸性条件下保存与使用；洛神花总黄酮储存和加工中应避光，避高温，避免接触强酸、强碱及Al3+、Cu2+、Fe2+金属离子。