拟南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物学信息分析及过表达载体构建

韦 春，杨莉琴，秦利军

(贵州大学农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室/生命科学学院，贵阳 550025)

油菜素内酯(brassinosteroids，BRs)是植物体内油菜素类固醇物质的总称，作为一种重要的类固醇激素，BRs调节植物多种生理生化反应，被称为植物界的第六大激素[1]。BRs除可调控植物生长与发育外，还能提高植物对外界胁迫环境的适应力，增强植株应答多种不良环境因素的抵抗力及耐受力[2-4]。目前，已知关于BRs合成的通路途径主要包括两条，即CN-依赖途径(CN-dependent pathway)和不依赖于CN的合成途径(CN-independent pathway)[5-6]。在CN-依赖途径中，芸苔甾醇(campesterol，CR)作为起始物，经过一系列氧化还原反应形成油菜烷醇(campestanol，CN)，CN又可通过早期的C-6氧化途径和晚期的C-6氧化途径形成芸苔甾内酯(brassinolide，BL)BL的直接前体油菜素甾酮(castasterone，CS)[5]。研究表明，在水稻(Oryzasativa)、拟南芥(A.thaliana)和烟草(Nicotianatabacum)中主要存在的是晚期C-6氧化途径[7]。在晚期C-6氧化反应途径中，CN经由C-22羟基化反应得到非氧化形式(cathasterone，CT)，下一步再形成睾丸酮(teasterone，TE)，经过类似早期C-6氧化反应途径，最后在C-6氧化得到CS。另一条途径是不依赖于CN的合成途径(CN-independent pathway)，CR通过不形成CN的八步催化反应形成BL，即CR依次经过DWF 4、CPD、DET 2、ROT 3/CYP 90 D 1、PsDDWF 1、BR 6 ox 1/2等多种酶的催化形成最终产物BL[5]。由此可见，无论是在何种通路中，DWF4基因均编码限速关键酶，调控着整个BRs的生物合成。早期研究表明，在拟南芥中，该基因被定位于3号染色体的短臂上，与A.thalianaCPD有66%序列相似性[8]。另有研究表明，DWF4是一种22-α羟基化酶，超量表达DWF4编码基因能显著增加BRs含量，引起A.thaliana花序和下胚轴长度明显伸长，提高种子产量[9]。本研究主要以A.thaliana植株为材料，以cDNA为模板对AtDWF4基因进行同源克隆，分析基因的结构及预测蛋白功能；同时，构建含AtDWF4基因的过表达载体并导入烟草K 326，为进一步研究过表达AtDWF4基因对转基因烟株形态及抗胁迫能力提供理想实验材料。

1 材料与方法

1.1 材 料

拟南芥(Arabidopsisthaliana)种子，大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态菌株DH 5α，均由贵州大学农业生物工程研究院保存并提供。Plant RNA Kit购于Bio-Tek OMEGA公司，胶回收试剂盒购自Invitrogen Ambion公司，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase，DNA 5 000 bp Marker，T4DNA ligase、DNA 2 000 bp Marker和pRI 201-AN植物表达载体均购于Takara公司；Plant RNA Kit购于Bio-Tek OMEGA公司，MultiScribeTMReverse Transcriptase Kit均购自Applied Biosystems公司；GelRedTM10 000×购于BIOTIUM公司；X-Gal、IPTG、氨苄青霉素(ampicillin，AMP)均购于Sigma-Aldich公司；克隆由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；目标片段测序由深圳华大基因科技有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1拟南芥cDNA的制备及AtDWF4克隆

取拟南芥植株幼嫩的叶片，按照植物总RNA提取试剂盒Plant RNA Kit提供的方法，提取拟南芥植株的总RNA，并反转录为cDNA，RT-PCR反应体系(20.0 μL)：10×RT Buffer 2.0 μL，25×dNTP Mix(100 mmol·L-1)0.8 μL，10×RT Random Primers 2.0 μL，RNA inhibitor 1.0 μL，MultiScribeTMReverse Transcriptase 1.0 μL，Nucleasefree H2O 3.2 μL，RNA template 10.0 μL。反应条件：25 ℃ 10 min；37 ℃ 120 min；85 ℃ 5 min；4 ℃保持。之后以cDNA为模板，以特异性引物DWF4-F(5′-ATGTTCGAAACAGAGCATCATACTCTCTTAC C-3′)和DWF 4-R(5′-TTACAGAATACGAGAAACCCTAATAGGCAAACCG-3′)进行PCR扩增。PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶中检测是否扩增出目标条带。

1.2.2目标片段连接及测序

按照Invitrogen Ambion公司胶回收试剂盒操作方法操作，回收PCR扩增的特异性条带并纯化。参照Promega公司pGEM-T Easy Vector Systems试剂盒说明将纯化的DNA片段连接入克隆载体并导入感受态E.coliDH 5α中，利用蓝白斑筛选法挑选阳性克隆送样测序。

1.2.3生物信息学分析

利用DNAMAN 7.0软件对基因编码的蛋白质氨基酸组成分析；利用ProtParam软件对蛋白质理化性质预测；利用在线工具ProtScale(http://web.expasy.org/ProScale)对蛋白质疏水性进行分析；SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html)对蛋白质二级结构进行预测。

1.2.4构建载体

以pRI 201-AN为原始载体(图1)，利用KpnⅠ/NotⅠ双酶切植物表达载体pRI 201-AN和人工合成的、两端(5′和3′)有KpnⅠ和NotⅠ位点的Prd29A∷AtDwf4∷THSP表达元件。该表达元件以植物逆境胁迫特异表达基因rd29A启动子(Prd29A)驱动AtDwf4基因表达、以热激蛋白(heat shock protein，HSP)基因终止序列(THSP)终止表达的表达框。分别回收pRI 201-AN双酶切的大片段，含有Prd29A∷AtDwf4∷THSP表达元件的小片段，在T4DNA连接酶的作用下，4 ℃过夜连接，连接载体经双酶切鉴定后分别导入感受态E.coliDH 5α和感受态AgrobacteriumtumefaciensLBA 4404中，获得工程菌。

1.2.5农杆菌介导的遗传转化

参照谭颖等[10]的方法对烟草K 326进行遗传转化。侵染叶片置于共培养基MS1(MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA)上，26～28 ℃黑暗培养3 d。共培结束后，叶块转移至脱菌筛选培养基MS2(MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+100 mg·L-1Kanamycin+150 mg·L-1Timentin)上，25 ℃，16 h光照/8 h黑暗培养2周，以诱导抗性芽分化。

2 结果与分析

2.1 AtDWF4基因克隆及测序

通过同源克隆，从A.thaliana扩增到一条1 000～2 000 bp的亮带，该片段依次经电泳、回收、T载体连接和大肠杆菌导入后送华大基因科技有限公司测序。利用DNAMAN 7.0软件对测序结果进行拼接、连接，得到全长为1 542 bp的基因序列(图2)。

2.2 AtDWF4基因编码序列分析

序列分析表明，AtDWF4基因可编码513个氨基酸；在线Protparam软件预测AtDWF 4蛋白等电点为6.62，带负电荷残基总数(Asp+Glu)为66个，带正电荷残基总数(Arg+Lys)为63个，即带电荷氨基酸为129个，占25.15%(weight)；酸性氨基酸66个，占12.87%(weight)；碱性氨基酸63个，占12.28%(weight)；非极性氨基酸222个，占43.27%(weight)；亲水性氨基酸146个，占28.46%(weight)。分子式简写为：C2661H4156N716O757S18；在线软件Proscale预测AtDWF 4蛋白在氨基酸第22、23、24位疏水性达到高峰，最大值为3.256；在第258位亲水性达到高峰，最大值为-3.544；总平均疏水指数为-0.301，推测拟南芥DWF 4蛋白可能为亲水性蛋白(图3)。

2.3 AtDWF 4蛋白二级结构预测

利用TMpred软件在线分析DWF 4蛋白跨膜区域，表明该蛋白存在3个跨膜区域，分别是第9位氨基酸到第28位氨基酸，方向为i-o；第112位氨基酸到第130位氨基酸，方向为o-i；第308位氨基酸到330位氨基酸，方向为i-o。SOPM法预测DWF 4蛋白质二级结构显示，该蛋白质二级结构(secondary structure of protein)主要含有α-螺旋、β-折叠、β-转角等(图4)。

2.4 pRI 201-RdDwf 4植物表达载体的构建

分别以KpnⅠ/NotⅠ双酶切原始植物表达载体pRI 201-AN和人工合成的两端含一致酶切位点的Prd29A∷AtDwf4∷THSP表达框。酶切大小片段在T4DNA连接酶作用下得到植物表达载体pRI 201-RdDwf 4。同时，利用KpnⅠ/NotⅠ对构建的植物表达载体进行酶切鉴定，获得2 552 bp(其中，Prd29A序列827 bp，AtDWF4序列1 542 bp；THSP序列183 bp)和10 432 bp两条带，证明该表达框已经成功导入原始表达载体(图5)。

2.5 烟草遗传转化研究

利用冻融法将载体pRI 201-RdDwf 4转入农杆菌LBA 4404，以叶圆盘转化法[18]对烟草K 326叶片受体进行遗传转化。烟草叶片依次经侵染、共培养、筛选培养得到叶缘出现分化的愈伤组织，且愈伤组织结构致密、呈浅绿色，另部分愈伤已分化出抗性芽(图6)。

3 讨 论

BRs作为存在于植物体内对植物的生长发育有众多影响的一类激素，其中最重要的作用就是调节植物的生长和增强植物对外界环境的胁迫反应抵抗能力[12-14]。它参与调控植物的光形态建成、细胞分裂和分化、生殖发育、开花、衰老等多种生长发育过程，减轻植物因生物或非生物胁迫受到的伤害[15-17]。目前，已知的关于BRs生物合成的关键酶有DET 2、CPD、DWF 4、ROT 3、CYP 90 D 1、BR 6 ox 1和BR 6 ox 2[18]。有研究报道，DWF4基因的过表达将导致内源BR的水平升高，从而影响植物生长发育[19]。本研究以拟南芥植株为材料，提取该植物的总RNA，并将其反转录为cDNA，以拟南芥cDNA为模板，设计引物DWF 4 F/R对AtDWF4基因进行同源克隆，扩增得到全长AtDWF4基因。以KpnⅠ/NotⅠ同时双酶切植物表达载体pRI 201-AN和含有KpnⅠ和NotⅠ位点的Prd29A∷AtDwf4∷THSP表达元件，该表达元件5′和3′端分别含有KpnⅠ和NotⅠ，经酶切后分别回收大片段和小片段，纯化后用T4DNA连接酶进行连接，通过酶切验证后构建DWF4基因的过表达载体pRI 201-RdDwf 4，成功构建了pRI 201-RdDwf 4植物表达载体，为今后对DWF4基因的进一步研究提供理论依据。