针刺联合达英-35治疗多囊卵巢综合征痰湿证的作用靶点研究

李修阳，李晓霞，张 宁，任 健

(1. 山东中医药大学中医学院，山东 济南 250355；2. 山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是临床上常见的一种病因复杂、临床表现多样的内分泌-代谢紊乱性综合征，其以生殖功能障碍(如月经紊乱、卵巢多囊样增大、雄激素异常等)和糖代谢异常(血糖异常、胰岛素抵抗等)为特征，在育龄女性的患病率为5%～10%[1]，是妇科疾病中的一种疑难性疾病。目前，西医主要是以激素类药物维持月经、促进排卵、改善内分泌紊乱等，多数患者因长期用药，逐渐引发肥胖、卵巢过度刺激综合征、多胎妊娠、流产率增高等一系列不良反应。中医疗法尤其是针刺疗法对预防和调治PCOS具有良好的疗效，但其对PCOS患者干预作用的分子机制和生物途径尚不清楚[2]。本研究旨在通过观察针刺联合西药对PCOS痰湿证患者内分泌激素及血清小分子代谢物代谢通路的影响，明确其调节内分泌功能的作用，发现针刺干预不同于药物的作用靶点，为针刺治疗PCOS提供足够的、具有说服力的科学依据。

1 资料与方法

1.1诊断标准

1.1.1PCOS诊断标准 参照美国生殖医学协会与欧洲人类生殖协会共同认定的鹿特丹标准[3]：①偶发排卵和/或无排卵。②临床和/或生化指标提示存在高雄激素血症，并排除先天性肾上腺增生、分泌雄激素肿瘤和库欣综合征等可能致病的因素。高雄激素血症的临床表现包括痤疮、多毛、秃顶，生化指标方面强调了游离睾酮的临床意义。③双侧卵巢多囊性改变：双侧卵巢有≥12个直径在2～9 mm的小卵泡，和/或单侧卵巢体积增大>10 cm3。以上3项具备任意2项或3项诊断为PCOS。

1.1.2痰湿证诊断标准 依据《中药新药临床研究指导原则》[4]及《中医妇科学》[5]中痰湿证临床诊断标准拟定：①月经周期延后，经量少，经色淡红，质黏腻如痰，或逐渐闭经，或婚久不孕；②胸腹痞满；③易恶心呕吐；④形体肥胖或四肢倦怠，神疲乏力；⑤白带多而黏腻；⑥舌淡胖或有齿印，苔腻；⑦脉滑。以上①必须具备，兼见其余各项中的3项即可诊断为痰湿证。

1.2纳入标准 符合上述诊断标准者；年龄20～40岁。

1.3排除标准 内分泌功能不正常者(如甲状腺功能减退/亢进、糖尿病、垂体肿瘤等)；合并心脑、肝胆等其他慢性消耗性疾病，不宜针刺者；患有精神系统、血液系统等疾病者；生殖系统或器官有器质性病变者；近3个月内应用影响生殖内分泌及代谢的激素类(如孕酮类、糖皮质激素类)药物者；妊娠期、哺乳期女性；配合性差者。

1.4一般资料 根据上述标准，纳入2018年5—11月于山东中医药大学附属医院中西医结合生殖与遗传中心门诊就诊的PCOS痰湿证患者40例，按照随机数字表法分为2组：西药组20例，年龄(28.1±2.6)岁，体质量指数(BMI)(29.03±3.00)kg/m2。针药联合组20例，年龄(28.2±3.8)岁，BMI(29.13±2.52)kg/m2。2组年龄、BMI比较差异无统计学意义(P均>0.05)。本研究符合《赫尔辛基宣言》伦理学要求。

1.5治疗方案 西药组：采用炔雌醇环丙孕酮片(达英-35，拜耳医药保健有限公司广州分公司，国药准字J20140114，规格：2 mg∶0.035 mg/片)治疗，从月经来潮或撤退性出血第5天开始连服21 d，每日1片，共治疗3个月经周期。针药联合组：炔雌醇环丙孕酮片用法同西药组，同时于每个月经周期的第5天开始给予针刺治疗，针刺选穴：气海、关元、中极、子宫、阴陵泉、丰隆、太溪、太冲、肝俞、脾俞、肾俞，除气海、关元、中极单取外，余穴均取双侧。选择0.35 mm×50 mm无菌针灸针(标准号：GB2024-1994)，75%乙醇常规消毒后针刺诸穴，得气后调至以患者感到舒适为度，留针30 min，期间行针2次，每日1次，每周5次，周末和经期休息，共治疗3个月经周期。若治疗期间受孕，可提前结束治疗，病情较重者可适当延长治疗周期。

1.6观察指标与方法 记录2组治疗前后BMI；检测2组治疗前后血清基础内分泌激素[促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)、雌二醇(E2)、睾酮(T)、空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)]水平，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)；应用核磁共振氢谱(1H-NMR)检测技术处理2组治疗后血清样本，筛选出血清中的代谢物及其参与的代谢通路。

1.6.1内分泌激素检测方法 2组患者分别于治疗前后在早卵泡期(月经第2～4天)或闭经期(B超下卵泡直径2～10 mm)采血，采血前禁食8～12h，空腹抽取静脉血，在常温下静置10～20min，2 000～3 000 r/min的速度离心20 min后分离出血清，采用化学发光法检测FSH、LH、E2、T、FPG、FINS水平。

1.6.21H-NMR检测方法 NMR检测用Varian 600 MHz谱仪，1H共振频率设为599.93 MHz。横向弛豫加权实验用水峰抑制的Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)序列，弛豫延迟为2.0 s，采集时间为1.5 s，谱宽为12 000.0 Hz，温度设置为25 ℃，总回波时间为100 ms，累加次数64次。首先将波谱仪输出的所有1H-NMR谱图进行预处理，将整理好的数据进行一系列的多元变量模式识别分析，使用SIMCA软件进行UV格式化处理，然后进行多元统计分析。本实验主要采用主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis,OPLS-DA)。PCA是将一组观测的可能相关变量，通过正交变换转换为线性不相关变量(即主成分)的统计方法，是一种可以在低维空间内利用少量主成分数量来更好地解释数据变量的分析方法，可有效评估样本的整体水平。OPLS-DA是通过七倍交叉验证、置换检验等对模型的有效性做进一步检验，可以排除非实验因素的影响，筛选出与疾病关系最密切的差异代谢物[6]。借助京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG) Pathway数据库[7](最常用的代谢网络通路数据库)，通过KEGG注释分析，找出全部差异代谢物所参与的代谢通路，综合分析(包含富集、拓扑分析)差异性代谢物所在的通路，筛选出与差异代谢物关系最密切的作用通路。

2 结 果

2.12组治疗前后BMI及血清内分泌激素、HOMA-IR比较 治疗前2组患者BMI、FSH、LH、E2、T、HOMA-IR比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。治疗后2组患者FSH、E2水平组间及组内比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；2组患者治疗后BMI、LH、T、HOMA-IR均明显低于治疗前(P均<0.05)，且针药联合组BMI、LH、T、HOMA-IR均明显低于西药组(P均<0.05)。见表1。

2.22组治疗后血清1H-NMR检测结果 2组PCA得分散点图提示样本基本全部处于95%置信区间内，见图1；OPLS-DA分散点图及排列检验图见图2及图3(R2X=35%。 R2X的值是对模型中所有X的变量解释率，可解释变量R2=70.4%，可预测性Q2=2.42%。OPLS-DA是有监督的模型,是人为地将样本分组，看组间是否存在差异，置换检验是对OPLS-DA模型的进一步验证，图中原模型的Q2和R2值均大于置换后的值，提示展示组间差异的置换检验模型稳定且不存在过拟合现象)。2组治疗后血清差异代谢产物OPLS-DA模型载荷图见图4(图中标记物质均为通过相关系数临界值检验的差异代谢物)，针药联合组患者治疗后血清中异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷氨酸等氨基酸，3-羟基丁酸酯、甘油等脂类，α-葡萄糖、β-葡萄糖等糖类物质均明显多于西药组(P均<0.05)，西药组中二甲胺明显增多(P均<0.05)。2组治疗后差异代谢通路分析气泡图见图5，显示有氨酰基-tRNA生物合成、柠檬酸循环(TCA循环)、糖酵解或糖异生、磷酸戊糖途径等糖代谢通路差异；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢等氨基酸合成与代谢通路差异；酮体的合成和降解、甘油脂代谢等脂质代谢通路差异；其中氨酰基-tRNA生物合成的富集程度最显著，是较为明显的差异代谢通路。

表1 2组多囊卵巢综合征痰湿证患者治疗前后BMI及血清内分泌激素、HOMA-IR比较

图1 西药组和针药联合组多囊卵巢综合征痰湿证患者治疗后血清PCA得分散点图

3 讨 论

古代医家根据PCOS临床症状，将其归入“闭经”“不孕病”等妇科疾病的范围中，并认识到本病的发生与痰湿有关，痰湿是引起PCOS的主要因素。

t[1]P表示第一主成分的预测得分；t[1]O表示正交主成分得分图2 西药组和针药联合组多囊卵巢综合征痰湿证患者治疗后血清OPLS-DA分散点图

虚线表示R2(可解释变量)和Q2(可预测性)的回归线图3 西药组和针药联合组多囊卵巢综合征痰湿证患者治疗后血清OPLS-DA排列检验图

医家许叔微最早提出了“湿痰、痰饮成癖囊”之说，并总结出了“燥脾以胜湿”的诊疗经验。元代医家朱震亨在《丹溪心法》中指出,女性先天素体湿盛，后天又恣食肥甘，定会使经血不畅，甚至难以摄精受孕。《万氏妇人科》也有类似记录，认为女性“肥硕，膏脂充满”，使“元户之门”无法打开，挟痰停滞，使气血运行受阻，血海蓄溢失常，而致月经不调，影响受孕。历代医家很早就认识到痰湿会引发女性肥胖、月经不调、不孕等临床表现，这些临床表现吻合现代PCOS的症状，这为PCOS痰湿致病理论提供了很多依据。

针刺治疗女性疾病已有悠久的历史，其通过调节经络、气血、阴阳等发挥作用。近些年，愈来愈多医家采用针药合用治疗PCOS以及其导致的不孕症，发现二者联合应用具有取长补短之功。郑淑珍等[8]对国内针刺治疗PCOS进行临床疗效、安全性的系统评价，发现针刺组与西药组的治疗效果相似，但在降低LH、T、LH/FSH水平及BMI方面针刺组明显优于西药组，对改善卵巢功能、提高卵子质量等也有明显优势，且安全。许娟等[9]研究发现，针刺联合西药(达英-35)治疗PCOS 2个月经周期，其效果明显优于西药治疗，可有效降低LH、T水平，并可提高患者排卵率。陈鹏典等[10]也做了近几年针药结合治疗PCOS的相关综述，发现针药结合治疗已成一种治疗趋向，二者结合改善子宫内膜容受性、排卵障碍的效果均优于单用药物治疗，安全性也明显提高。

标记物质均为通过相关系数临界值检验的差异代谢物；颜色的深浅表示相关系数的大小，红色表示强相关，蓝色表示弱相关图4 西药组和针药联合组多囊卵巢综合征痰湿证患者治疗后血清OPLS-DA模型载荷图

气泡表示不同代谢通路；横坐标表示该通路在拓扑分析中的影响因子，气泡越大影响因子越大；纵坐标表示富集分析的P值，颜色越深P值越小，富集程度越明显图5 西药组和针药联合组多囊卵巢综合征痰湿证患者治疗后差异代谢通路气泡图

PCOS痰湿证与肾、肝、脾三脏功能关系密切，任脉为“阴脉之海”“主胞胎”，故针刺治疗此证大多从任脉、肾经、肝经、脾经选取穴位。关元为小肠募穴，其深部即为胞宫所在,可补先天之元气、温肾暖宫、调理任脉；中极为膀胱募穴，是肾经、肝经、脾经与冲任脉交会穴，“应胞宫精室”，调理冲任、利散水湿；气海为先天元气所聚之处；三穴合用，可增强培补元气之效，且三穴均居脐下，又可起到局部治疗作用，更利于调和气血，疏利下焦气机。子宫穴属于外经奇穴，局部取穴可调节子宫血气运行，利于调节月经、改善卵巢功能等。肾俞为肾之背俞穴，为补肾要穴，可补益肾精；太溪穴为肾之原穴，与肾俞穴合用，可滋肾阴、益肾阳。PCOS痰湿证患者体内水湿过盛，脾恶湿，湿必犯脾，故取脾之合穴阴陵泉，脾之背俞穴脾俞，以清利湿热、健脾理气；胃之络穴丰隆，为祛痰要穴，可健脾祛痰，疏通气血阻滞，诸穴配伍，增强健脾祛湿化痰的作用。女子“以肝为本”，且肝肾同源，取肝之原穴太冲穴，肝之背俞穴肝俞，利于疏肝理气、清肝泻火。三阴交为脾经穴位，是足三阴经的交会穴，可疏通气血、健脾益胃、补肾调肝。诸穴同用，共奏补肾健脾、利湿化痰、调理冲任之功。本研究结果显示，西药和针刺联合西药均对FSH、E2影响不明显，而对BMI、LH、T、HOMA-IR影响显著，且针刺联合西药组治疗对上述指标的改善作用明显优于单纯西药组，进一步证实针刺治疗在调节PCOS患者内分泌水平方面具有较大优势。

生物体中代谢组产生系统性的变化，需要体内复杂代谢反应与不同基因及蛋白质共同构成的复杂通路和网络之间相互调控、作用，通过分析这些代谢通路，可以更加全面系统地明白疾病的病因病机、药物作用机制等生物学问题。本研究结果显示，2组治疗后存在多条代谢通路差异，其中针药联合组氨酰基-tRNA生物合成的富集程度最为显著。氨酰基-tRNA在蛋白质的合成中起着重要作用。蛋白质是构成人体细胞、组织的重要有机物质，如神经递质、抗体、受体、酶等生理活性物质均离不开蛋白质，其承担着整个生命活动。氨基酸是合成蛋白质的特有原料，其量不足与胰岛素抵抗关系密切，异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸与胰岛素抵抗明显呈负相关[11]。针药联合治疗后，差异代谢物中的氨基酸种类、数量明显增加，这可能是纠正胰岛素抵抗的重要因素。结合2组治疗后的差异代谢物及代谢通路发现，针刺干预可能是整体调节糖、脂、氨基酸代谢功能，通过TCA循环、糖酵解或糖异生、磷酸戊糖途径等代谢通路为合成氨基酸提供相应的碳架，增强缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成及苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成等通路生成新的氨基酸，也为进一步合成蛋白质提供基础。生成的氨基酸经过活化脱水缩合形成多肽链，再结合特定的t-RNA,在氨酰基-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase,aaRS)的催化作用下，生成不同类型的氨酰基-tRNA。aaRS可准确识别特定的氨基酸和tRNA并结合二者，使形成的氨酰基-tRNA顺利将氨基酸运送至核糖体，再经过一系列复杂的翻译、加工等过程，参与蛋白质的合成。aaRS只作用一种氨基酸，具有校正、更正的活性，可水解其错误活化的氨基酸，换上相应的氨基酸，具有高度特异的识别功能。PCOS机体处于慢性缺氧状态而导致能量代谢抑制，这可能与aaRS有密切关系。有研究报道，线粒体aaRS病变可引起线粒体疾病表型异常[12]，线粒体功能障碍是PCOS发生胰岛素抵抗的发病机制[13]。糖的有氧氧化分解需在线粒体中进行，若线粒体aaRS功能障碍，会限制体内代谢通路的正常运行，会抑制机体的正常能量代谢，进而引发疾病。PCOS痰湿证的临床症状可能与此有关，故推测线粒体aaRS很可能是针刺干预的作用靶点，针刺可能对其有修复作用，并能够调节其活性，进而整体调节体内能量代谢，改善PCOS痰湿证患者的内分泌紊乱和排卵障碍，最终提高妊娠率。

总之，本研究证实针刺联合西药对PCOS痰湿证患者体内代谢有明显干预作用，其可能通过影响氨酰基-tRNA生物合成，以修复并调节线粒体aaRS活性为作用靶点，促进体内氨基酸代谢及糖脂代谢，这为临床针刺治疗PCOS的疗效机制研究提供了分子生物学证据，对探索其参与的代谢通路及干预的作用靶点，揭示其分子生物学机制具有重要意义。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。