采用不同提取方法、利用超高效液相色谱-串联质谱检测鸡肉中喹诺酮类药物残留的影响

王 磊 刘延平 王鲁霞 朱 辉 陶相锦

菏泽市食品药品检验检测研究院 山东菏泽 274000

喹诺酮类药物是在动物产品中常用的合成抗生素类药物，但是过量的使用会在动物食品中残留，并进一步危害人类的身体健康。在畜禽产品的兽药残留检测技术上与发达国家相比存在一定的差距，使得国内市场时常发生畜禽产品质量安全问题，严重影响出口贸易。同时，在动物源性食品中滥用抗生素类药物，还会导致各种耐药菌株的出现。目前，世界各组织与欧盟等国，对于喹诺酮类药物在畜禽产品中的残留量都做了具体规定；食品安全国家标准规定，禽肉中恩诺沙星的最大残留限量为100μg/kg；在肝脏和肾脏中的限量要高，分别不得高于200、300μg/kg，而氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、诺氟沙星不得检出。

畜禽产品的基质成分十分复杂，在对样品进行分析检测时，会有不同程度的基质干扰现象，所以在进行检测之前，要尽量消除基质对于实验结果的干扰。对动物源性食品中兽药残留的检测，学者进行了探究。而喹诺酮类药物的检测方法主要有高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)、酶联免疫吸附技术(ELISA)等[1]。在测定动物源性食品兽药残留量的技术中，目前常用的提取方法，如超声萃取技术[2]、固相萃取法[3]等，都可以有效地提取目标药物、消除基质干扰。目前，提取溶剂的种类较多，它们的理化性质不尽相同，即使是相同种类的溶剂，其配比不同，分离提取效果也会不同。不仅如此，在检测分析的过程中，提取过程的不同环节，都会影响药物残留检测分析。对于采用液质联用法检测鸡肉中喹诺酮类药物残留的问题，其解决问题的关键，是要建立科学的检测技术，以便能更好的监测动物产品中药物的残留量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

喹诺酮标准混合溶液，美国A Chemtek公司提供，批号：S039627，浓度100μg/mL，用甲醇溶解配制成浓度为1.0μg/mL的标准中间储备液，临用时准确量取适量标准储备液用流动相稀释成适宜浓度的标准工作液。

化学试剂：乙腈、甲醇、甲酸、色谱纯；所有试剂均用超纯水配制。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱-质谱联用仪TQ-S，Waters公司；

电子分析天平ME204，METTLER TOLEDO公司；

高速冷冻离心机3K15，德国SIGMA公司；

数控超声波清洗器KQ-500DB型，昆山市超声仪器有限公司；

固相萃取装置，Waters公司；

氮气吹干仪OA-HEAT型，Organomation公司；

多管漩涡混合仪HD-2500型，杭州佑宁仪器有限公司；

具塞塑料离心管；

有机相针式滤器(0.22μm)；

HLB固相萃取柱Oasis Prime HLB 6 cc/200 mg，Waters公司；

移液枪200μL、1mL，Eppendorf公司。

1.3 样品溶液的制备

准确称取已均质的鸡肉制品2.00g于50mL聚丙烯离心管中，加入10mL 0.2%甲酸/乙腈/水溶液(80+20)，摇匀分散后涡旋提取2min，超声波提取15min，以8 000r/min离心15min，取一定量的上清液用Prime HLB固相萃取柱进行净化，控制流速不超过1.0mL/min。净化液于45℃条件下用氮气蒸发至近干，加入1mL 0.1%甲酸/乙腈/水溶液(10+90)涡旋复溶，过0.22μm微孔滤膜，用HPLC-MS/MS检测。

1.4 色谱及质谱条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱参数：Acquity UPLCHSS T3(2.1 mm×100 mm，粒径1.8 μm)。

流动相：乙腈为A相，0.1%甲酸/水溶液为B相，流动相初始比例为A∶B=10∶90(V/V)，线性梯度洗脱(0～1min，10%A→10%A；1～3.5min，10%A→90%A；3.5～4min，90%A→90%A；4～4.1min，90%A→10%A；4.1～6.5min，10%A→10%A)。

流速：0.3mL/min。

柱温：40℃。

进样体积：5μL。

1.4.2 质谱条件

质谱条件：离子源为电喷雾离子源(ESI)。

扫描方式：正离子扫描。

监测方式：多反应监测(MRM)。

毛细管电压：3 000V。

离子源温度：350℃。

2 结果与分析

2.1 不同提取液的影响

甲醇、乙腈、乙腈/水、乙腈/水/0.2%甲酸作为萃取剂时，相应的实验结果如表1所示。

测定喹诺酮类药物在鸡肉样品中加标量为5ng/g水平上的回收量。结果显示，使用乙腈和乙腈/水(80+20)溶液作为萃取剂时，萃取率相对较低；使用甲醇作为提取剂时，回收率比使用乙腈和乙腈/水(80+20)高，但环丙沙星未检出。

表1 不同提取液的影响

表1中结果显示，当在体积分数为80%的乙腈/水溶液中加入0.2%甲酸作为提取溶剂时，7种喹诺酮类药物的提取效率较高，因为80%的乙腈能使样品中的蛋白质缓慢的进行变性，离解与其结合的药物，而用纯乙腈提取液时，由于乙腈浓度过大，使得蛋白质快速变性，从而迅速凝聚包裹住目标喹诺酮药物，提取液不能充分接触药物，导致提取率较低[4]。当用甲醇作为提取液时，由于甲醇不能使样品中的蛋白质充分变性，使得药物与蛋白质的结合态不能被充分破坏，从而使喹诺酮药物的提取率较低。采用80%的乙腈/水/0.2%甲酸溶液提取体系，能完全破坏蛋白质与喹诺酮类药物之间的强结合作用，使药物充分的释放到提取溶剂中，得到较高的提取效率，加入0.2%甲酸的目的是为了在进行质谱检测过程中提高其检测信号值。同时，80%的乙腈/水/0.2%甲酸溶液具有较强的极性，强极性使得提取液中脂溶性杂质减少，有利于质谱的检测。所以本实验选用80%的乙腈/水/0.2%甲酸溶液作为提取鸡肉中喹诺酮类药物的最佳溶剂。

2.2 超声时间的影响

为了进一步阐明鸡肉中超声提取时间对提取喹诺酮类药物的影响，选择不同的提取时间来提取药物，本实验考察了不同的超声提取时间(5～30min)对恩诺沙星、氧氟沙星、沙拉沙星，这3种典型喹诺酮类药物提取效果的影响。从图1中可以看出，不同提取时间对沙星的提取影响较为显著。超声波提取能使样品完成均一化。这可能是由于超声提取法虽然能将喹诺酮类药物从细胞中提取出来，但过低的提取时间很难对样品萃取做到完全均质统一。样品经过超声处理，提取率有所提高，而超声15～20min时，超声波对喹诺酮类药物的破坏性较大，明显比超声提取10min时低，提取效果不佳。当超声30min时，通过超声可以使细胞破裂，从而溶出更多喹诺酮类药物，提取效果较优，但提取时间较长，且操作局限性大，不符合快速检测的要求。因此，超声提取10min效果最佳。

图1 超声时间的影响Fig. 1 The influence of ultrasonic time

2.3 净化柱Prime HLB柱的影响

本实验比较了不同的上柱体积对样品中7种喹诺酮类药物的净化、提取效果。提取溶剂在提取鸡肉样品中喹诺酮类药物的同时，也会将鸡肉样品中其他成分提取出来，因此需要对样品的超声提取液进行净化处理。为了更好的提纯目标化合物，提高色谱柱的性能，本实验采取Prime HLB柱作为净化柱。实验结果如表2所示，测定喹诺酮类药物在鸡肉样品中加标量为5ng/g水平上的回收量。采取Prime HLB柱，3～5mL直接上样的回收率较高，主要原因是直接过滤法属于物理过滤法，除了去除大分子蛋白质和脂肪等杂质外，并不会除去喹诺酮这类小分子的物质，所以回收率较高。因此，本方法可以简化实验操作步骤，减少了喹诺酮类药物在实验过程中的损失，降低了实验检测成本。

表2 不同体积的影响

2.4 不同加标量的影响

取空白鸡肉样品中添加4个浓度水平的混合标准液，按优化所得的前处理方法进行处理，做回收率试验，每个水平重复3次。本实验考虑到鸡肉中脂肪含量较高，采用柱净化富集进行预净化处理。所以，目标化合物在前处理过程中会有损失。

表3 不同加标量的影响

由表3可知，洛美沙星和氧氟沙星的回收率不高，可能是由于基质成分对喹诺酮类药物的干扰所致。采取Prime HLB柱作为净化柱除去大量杂质的同时，也将喹诺酮类药物带走，导致回收率不高，而加标量为5ng/g水平上的回收率均大于60%，符合食品中喹诺酮类药物检验检测标准要求。

3 结论

本研究通过利用高效液相色谱串联质谱具有高效、高灵敏度的特点，优化了同时检测鸡肉中7种喹诺酮类药物残留的分析方法。同时，液质联用法采用的多离子反应监测模式，使喹诺酮类药物的色谱峰图有足够的数据采集点数，提高了灵敏度，降低了检测限[5]。通过分析不同种类提取溶剂、超声时间、净化体积、加标量对提取效果的影响，快速、高效的将多种喹诺酮药物分离，所提取的药物能够进行准确的定量分析。本实验方法适用于鸡肉中喹诺酮类药物的检测分析，具有灵敏度高、分析快速等特点，可满足鸡肉中喹诺酮类药物多残留检测的需要。