结核性脓胸86例患者术中留取胸膜组织行耐药基因检查PCR的临床研究

吴进超，邵金凤，侯野，徐微，李秋，高欣悦

（1.吉林省结核病医院 胸外科，吉林 长春 130500；2.吉林省结核病医院 检验科，吉林 长春 130500；3.长春市传染病医院胸外科，吉林 长春 130500）

0 引言

结核病作为一种严重的传染病，对人们的生命安全产生了巨大的威胁[1]。而随着抗结核药物的广泛应用，许多结核病患者出现了耐药性，这就对疾病的预防与治疗带来了不利的影响，结核病耐药的出现，使得患者的治疗成本升高，耐药结核病患者治疗周期长，若不能最短时间了解耐药情况，则会对治疗效果产生严重的影响。随着结核病发病率增加和耐药结核增多，外科手术治疗肺结核的重要性再次显现[2]。全球耐药肺结核治愈率在50%左右，外科干预后其治愈率可明显提高[3-5]。这就需要进行快速药敏试验准确的诊断，为疾病治疗提供可靠保障。因此，本研究在选取86例脓胸患者组织标本作为样本的基础上，对荧光PCR探针熔解曲线技术检测结核分枝杆菌对五种抗结核药物的耐药性进行研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月-2020年12月吉林省结核病医院收治的118例结核性脓胸患者中进行抽样，均进行了结核分枝杆菌耐药基因PCR检测，将结核杆菌耐药基因检测PCR阴性者排除，检测阳性为86例，同时证实为结核分枝杆菌的86例阳性标本为研究对象，所有患者均经病原学或病理学证实，或符合结核性脓胸诊断标准。患者中男63例，女23例；平均发病年龄37.52岁。所有患者均行胸膜剥脱术术中留取胸膜组织经培养证实为结核分枝杆菌的86例阳性标本为研究对象，对结核性脓胸患者，术中行胸膜组织耐药基因检测及结核菌培养，近期指导结核用药，远期对比耐药基因检测及PCR的准确性，以达到快速做出是否为结核及耐药的诊断，并指导临床用药，达到精准诊断及精准治疗。

1.2 仪器与试剂

在此次研究中选取的临床分离株，在进行硝基苯甲酸生长试验进行鉴定之后，均为结核分枝杆菌。在研究当中，使用的试剂与仪器为RFP、EMB、INH、Sm、左氧氟沙星以及PNB含药培养基，同时选用4%的NaOH溶液以及各种耐药突变检测试剂盒。选用的仪器为SLAN-96s型实时荧光定量PCR仪以及BY-R18型低温高速离心机；分离培养专用酸性罗氏培养基由吉林省结核病医院检验科结核分枝杆菌培养室自制。

1.3 组织类标本预处理方式

取少量典型新鲜组织10mg，加入200µL的缓冲液ATL、20µL蛋白酶K，于56℃消化处理至组织消化完全。离心后取上清，加入300µL F5或TB DNA提取液，振荡混匀重悬，99℃灭活10min，待用。仪器提取：打开Lab-Aid 824核酸提取仪电源，仪器启动完成后，仪器控制屏出现初始界面。将试剂条在桌面上轻轻磕碰，使各试剂落入管底，然后从核酸提取仪中取出试管条架，将试剂条放在试管条架上，撕去封管膜。标注号标本对应编号。在各试剂条的左边第一孔（大孔）中分别加入60µL DTT溶液（1mol/L）、20µL增强液及180µL Buffer N。将取处理好的痰液，灌洗液、冲洗液样本1.5mL加入试剂条左边第一孔（大孔）中。将试管条架放入仪器中，试管条架要推到位。将搅拌条插入搅拌架上，要插到位，并用卡扣卡住。选择实验“程序运行”—“选择程序”—“MTB-Maxi-1”，然后“返回”2次，点开始运行程序。运行过程大约45min。仪器程序运行完成后，仪器会鸣笛提示。取出试管条架，各试剂条的最后一孔为纯化的DNA，分别吸出，放入对应编号的离心管中，备用。最后洗脱液中可能会有少量磁珠残留，若需去除残留的磁珠，可用磁力架手工分离，或将DNA溶液于12000rpm离心1min，收集上清即可。石蜡标本：取3～5片石蜡切片，脱蜡后根据新鲜组织处理方法处理。取出PCR反应管，在管壁上做好标记，离心半径5cm，5000r/min，离心，扩增。之后进行杂交，洗膜，显示结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行分析，PCR-反向点杂交检测与药敏试验对研究对象耐药结果的比较，采用McNemar检验，以P<0.05为差异有统计学意义。对结核分枝杆菌耐药检测PCR检测与药敏检测结果进行Kappa≥0.75为两者一致性较好，0.4～0.75为一般；Kappa<0.4为一致性差。

2 结果

PCR-反向点杂交检测结果：118例患者中，86例结核分枝杆菌阳性，阳性率为72.88%。其中86例中55（63.95%）例未检出H、R、S、E、喹诺酮类耐药基因突变；31例（36.05%）检出H、R、S、E、喹诺酮类基因突变。PCR利福平敏感79例，耐药7例，耐药率为8.14%（7/86），未检出0例；异烟肼敏感68例，耐药18例，耐药率为20.93%（18/86），未检出0例；盐酸乙胺丁醇敏感73例，耐药10例，耐药率为11.63%（10/86），未检出3例；氟喹诺酮类敏感69例，耐药11例，耐药率为12.79%（11/86），未检出6例；链霉素敏感54例，耐药20例，耐药率为23.26%（20/86），未检出12例。详见表1。

表1 PCR-反向点杂交法与药敏试验对86例结核分枝杆菌检测阳性患者耐药检测的比较（n,%）

3 讨论

临床上用于结核分枝杆菌耐药检测的主要方法是培养法及药敏试验，被誉为“金标准”[6-9]。但此方法操作复杂、费时，一般需要4～8周，诊断周期长，且培养困难，敏感度低，不能及时指导用药[10]。随着分子生物学诊断技术的不断进步，结核分枝杆菌的耐药突变基因检测得到了很快发展[11]。PCR-反向点杂交技术是将PCR-技术的高敏感度，反向斑点杂交技术的高特异性和膜芯片技术的高通量3种成熟技术的优势有效结合的快速基因诊断手段，可同时检测4种一线药物的5个常见耐药相关基因上13个位点的突变[12-14]。并且，其与培养法及药敏试验相比，简便快速，8h即可得出结果。结果显示，两种方法检测结果差异无统计学意义。

本研究选取了118例脓胸患者，86例结核分枝杆菌基因检测阳性，阳性率为72.88%；其中，31例发生耐药基因突变，与文献报道的基本相符[15]。荧光PCR探针熔解曲线是目前临床应用较为广泛的一种分子检测技术，具有较高的可靠性，相关文献表明其敏感度达85.5%～100%，特异度达100%，但所示文献均以PCR-直接测序为金标准。我们发现其感染结核菌临床分离菌株对R、H、E、S及喹诺酮类的耐药基因突变，并分析在MTB耐药基因检测中使用荧光PCR熔解曲线法的应用价值。