山羊精子形态异常的几种检测方法

林尔喜 许鹏 覃孝杰 邓祝新 彭燕*

（1，广西灵山县动物疫病预防控制中心 535499；2，广西畜禽品种改良站 530001）

精子形态分正常精子和异常(又称畸形) 精子，在畸形精子中又分头部畸形、尾部畸形和其他类畸形（比如粘连）。据报道，精子形态与受精关系密切，精子形态异常（畸形），受精能力下降。公羊鲜精畸形率超过15%，受胎率下降，畸形率超过50%，受胎率急剧下降（羊冷冻精液畸形率超过20%，受胎率下降，畸形率超过55%，受胎率急剧下降）[1]。笔者结合长期的工作实践经验，介绍几种山羊精子形态异常的检测方法，供同行参考。

1 检测药品、仪器设备等的准备

显微镜、带动物用精子分析仪[SMAS]软件的电脑、5～10μl 移液枪、定量采血管、血细胞计数板、计数器、小试管、滴管、载玻片、22×26mm 盖玻片、18×18mm 盖玻片、载玻片架、染色平槽、姬姆萨染液（预先配制好）、2%伊红溶液、中性福尔马林固定液（预先配制好）、3%氯化钠溶液、稀释好的羊精液样品[2]。

2 检测方法

2.1 常规检测法

2.1.1 抹片

准备好写有羊号的载玻片，用移液枪取稀释好的羊精液样品10μl 至载玻片一端，用另一片载玻片的一端与样品呈35°夹角，将精液样品均匀拖于载玻片上，自然风干15min，制成抹片，每个精液样品制备2 个抹片。

2.1.2 固定

在每个风干的抹片上滴2ml 中性福尔马林固定液，固定15min 后用清水缓缓冲去固定液，然后置于载玻片架上自然风干或吹干。

2.1.3 染色

将固定好的抹片反扣在染色平槽上，用滴管取适量姬姆萨染液充满染色平槽中，使染液与抹片接触，染色1.5h 后用清水缓缓冲去染液然后置于载玻片架上自然风干或吹干。

2.1.4 镜检

将制好的抹片在200 倍显微镜下选择多个区域，用计数器计数正常精子数和畸形精子数，每个抹片计数精子200 个以上，算出畸形率，两片抹片畸形率检测结果的平均值为该样品的精子畸形率；同一个精液样品制备的2 个抹片计数差值大于6 则需重做。

2.2 快速抹片法

2.2.1 抹片

准备好写有羊号的载玻片，用移液枪吸取稀释好的羊精液样品5μl 至载玻片一端，加5μl 预先配制好的2%伊红染液混合均匀，用另一片载玻片的一端与样品呈35°夹角，将精液样品均匀拖于载玻片上，自然风干15min，制成抹片，每个精液样品制备2 个抹片。

2.2.2 镜检

方法同上（2.1.4 镜检）。

2.3 抹片油镜检测法

2.3.1 抹片

方法同上（2.2.1 抹片）。

2.1.2 镜检

打开连接显微镜带动物用精子分析仪[SMAS]软件的电脑，将制好的抹片在显微镜油镜下，选择上下、左右、中等多个区域，用计数器计数正常精子数和畸形精子数，每个抹片计数200 个以上，算出畸形率，两片抹片检测结果的平均值为该样品的精子畸形率；同一个精液样品制备的2 个抹片计数差值大于6 则重做。没有动物用精子分析仪[SMAS]软件也可以在普通显微镜油镜下1000 倍镜检。

2.4 血细胞计数法

2.4.1 样品准备

用定量采血管吸取10μl 稀释好的羊精液样品至盛有3%氯化钠溶液990μl 的小试管内，混均使之成为100 倍稀释的精液样品，待用。

2.4.2 制片

将血细胞计数板洗净风干，用22×26mm 盖玻片将计数板的计数室盖好，用移液枪取稀释100 倍的羊精液样品10μl 至盖玻片边缘，轻轻打出，使精液样品自行流入计数室，并均匀充满，同样方法给另一侧的计数室加样，静置5min 后镜检。加样时有气泡或充不满需重新做。

2.4.3 镜检

将制好的计数板置于显微镜下100 倍镜检，计算正常和畸形精子数，每个计数室计数200 个以上的精子，算出畸形率，上下两个计数室的检测结果的平均值为该样品的精子畸形率。

2.5 压片法

2.5.1 制片

先取2%伊红溶液2μl 于载玻片上，加2μl 稀释好的羊精液样品混均，用18×18mm 盖玻片盖好，一片载玻片上可做3个压片，静置1min 后镜检。

2.5.2 镜检

将制作好的玻片置于显微镜下100 倍镜检，计算正常和畸形精子数，每个压片计数精子200 个以上，算出畸形率，3 个压片的检测结果的平均值为该样品的精子畸形率。

3 5 种方法对比

5 种常规检测法对比，参见附表。

附表 5 种具体方法

4 小结与讨论

在羊业生产中，定期对种公羊精液品质进行检查，随时掌握用种公羊的精液品质情况，对提高母羊繁殖率意义重大。检测公羊精子畸形率是精液品质中的一项重要检查，目前羊精液形态常规检测法主要用于正规质检；快速抹片法操作方法简单、出结果时间短，在生产上比较实用；其他方法在实际生产上只作参考用。