菊芋提取物对黄褐天幕毛虫营养状况及酶活的影响

PHAM HUNG HAI,邹航,吴德东,曾健勇,张国财,张杰

(东北林业大学林学院，哈尔滨150040)

黄褐天幕毛虫(Malacosoma neustria testacea)，属鳞翅目(Lepidoptera)、枯叶蛾科(Lasiocampidae)，取食果树和阔叶树的叶片，大发生时可损害全部树木叶片，导致次年林木生长情况严重受损，降低果实产量，影响林业经济发展，为此人们对该害虫进行防治研究。经前人研究得出，白屈菜和走马芹20倍液对黄褐天幕毛虫的毒杀作用不明显，但高渗苯氧威1500倍液的作用下，校正死亡率可达100%[1]。通过野外林地实验可知，使用20%杀铃脲悬浮剂48 h后，幼虫取食量降低，施药72 h后25%的天幕毛虫不再进食，且虫体缩小，最终死亡[2]。在灭幼脲Ⅲ号胶悬剂对幼虫和卵进行杀虫实验中，当2龄幼虫取食用50～100μg灭幼脲Ⅲ号处理过的食物后，平均校正死亡率可达到100%[3]。

近年来，具有对环境污染小、杀虫效果显著等特点的植物性杀虫剂得到广泛应用，成为害虫防治重要手段。使用除虫菊素处理72 h后，异迟眼蕈蚊(BradysiadifformisFrey)的校正死亡率可达到90%，说明除虫菊素对异迟眼蕈蚊有一定的杀虫效[4]。在0.5～3.0 mL/孔的使用剂量下，辣根素可有效地防治天牛(Cerambycidae)[5]。除虫菊素、鱼藤酮、印楝素和苦瓜叶提取物对螺旋粉虱(Aleurodicusdisperses)均具有较强的毒杀效果，并且在很大程度上降低了昆虫产生抗药性的能力[6]。小菜蛾(Plutellaxylostella)在蒙古扁桃叶片乙醇提取物的胁迫下，虫体出现不规则生长现象[7]。对米象(Sitophilusoryzae)的防治实验发现，香樟精油对米象有较高的驱避作用，而丁香精油对其触杀作用最强，丁香和肉桂皮精油具有最高的熏蒸致死率[8]。韭菜挥发油对小菜蛾触杀毒性的LC50为0.56μL/mL，而韭菜提取物对小菜蛾触杀毒性的LC50为3001.88 mg/L[9]。当龙葵根和泽漆根的提取物浓度为200 mg/mL时具有较强的杀螨(Tetranychusurticae)活性，杀虫活性分别为95.5%和49.4%[10]。

因此，研究菊芋提取物对黄褐天幕毛虫营养状况和酶活的影响，为今后对其更深入的研究提供了理论依据，对黄褐天幕毛虫的防治工作提供了研究基础，具有一定的现实意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物与昆虫：黄褐天幕毛虫采自东北林业大学校园内杨树上，使用一次性养虫盒进行饲养，温度25 ℃，相对湿度为40%～60%，光暗条件为16/8 h，选取3龄幼虫进行实验。黑心菊花、波斯菊花、菊芋花采自东北林业大学校园内。用烘箱将3种菊花烘干，磨成粉末状，将菊花粉末保存于广口瓶中。

试剂及仪器：电子分析天平(型号为Adventure AR2130)，FS30C昆明小型超微粉碎机，雷迈中药材超微粉碎机，SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司),SK20G超声清洗器，R-1001VN旋转蒸发仪，分析纯AR无水乙醇，低温离心机。试剂及仪器：分析纯AR无水乙醇，酶活试剂盒购自南京建成生物工程研究所。Adventure AR2130型电子分析天平，雷迈超微粉碎机，SHB-III型循环水式多用真空泵，SK20G型超声清洗器，R-1001VN型旋转蒸发仪，D3024R型号低温离心机。

1.2 试验方法

1.2.1 提取物的制备。分别称取50 g黑心菊、波斯菊及菊芋3种植物干粉末，使用乙醇提取，在料液比为1∶50(g:mL)、采用超声波提取法对以上3种植物活性物质进行提取，条件60 min、温度50 ℃、各植物提取物均制成20 mg/mL的供试药剂4 ℃保存。

1.2.2 试虫处理。采用胃毒的方法对3龄黄褐天幕毛虫进行处理，浓度为20 mg/mL，将三种菊提取物喷洒在树叶上，取饥饿24 h的3龄幼虫进行饲喂，15头一组，3个重复处理，幼虫取食树叶后，在12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h记录幼虫死亡数。

选择杀虫效果最好的提取物进行下一步试验，选3龄黄褐天幕毛虫，每组15头，设3个重复，在12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h分别取样，使用液氮冷冻后放入-80℃保存。随后进行保护酶(SOD、CAT、POD、PPO)、解毒酶(GST)活性测定，以及蛋白质、碳水化合物、海藻糖含量的测定。

1.2.3 解毒酶和保护酶活力测定。酶液的制备：取0.1 g虫体组织，用液氮进行研磨，加入适量提取液或生理盐水，涡旋2 min后在12000 rpm 4 ℃离心10 min，取上清待测。测定解毒酶GST和保护酶SOD、POD、CAT、PPO的活性。

1.2.4 蛋白质、碳水化合物、海藻糖含量测定。蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250法进行测定，碳水化合物含量和海藻糖含量采用石疆红等人的方法并进行改进[11]，取整头虫进行各项指标的测定。

1.3 数据分析

采用SPSS 22.0软件及Excel软件进行数据统计分析，采用One-Way ANOVA LSD Duncan分析差异显著性，柱形图均采用SigmaPlot 10.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 毒力测定

挑取虫龄大小一致、健康的黄褐天幕毛虫进行毒力测定，从表1可知，在20 mg/mL浓度下，菊芋提取物对黄褐天幕毛虫的致死率高达97.52%，浓度为20 mg/mL的黑心菊的提取物处理下黄褐天幕毛虫的死亡率为82.7%，而相同浓度下波斯菊提取物处理下的死亡率仅为3.71%，因此选择菊芋进行后续试验。

表1 三种菊花提取物对黄褐天幕毛虫幼虫的毒力测定

2.2 解毒酶和保护酶活力影响

解毒酶和保护酶是昆虫体内重要的两种酶，在昆虫的生长发育过程中起到维持昆虫正常生长的作用，对其进行检测从而了解菊芋提取物对黄褐天幕毛虫体内不同酶活力的影响情况。

由图1可知：菊芋花提取物对黄褐天幕毛虫SOD酶活性有显著影响。在处理后12 h SOD酶活性被抑制，与对照相比，酶活力下降了0.07倍。处理后24 h SOD酶活性表现为被激活，处理酶活力为对照组的1.35倍。处理后48 h对照组的SOD酶活力为41.34 U/mg，处理组的酶活力为26.11 U/mg，同比下降了0.37倍。在处理后72 h，SOD酶活力变化极显著，处理组为对照组的0.67倍。

图1 黄褐天幕毛虫SOD活力

由图2可知：菊芋花提取物对黄褐天幕毛虫POD酶活性有显著激活作用。POD与SOD酶活性表现相同，在处理后12 h酶活性被显著抑制，与对照相比，酶活力下降了0.4倍。处理后 12 h、48 h、72 h POD酶活性表现均为激活，在处理后24 h最为显著，为对照组的1.6倍。48 h和72 h的对照组POD酶活力分别为22.85 U/mg和21.06 U/mg，处理组POD酶活力分别为25.92 U/mg，24.03 U/mg，均呈激活作用。

图2 黄褐天幕毛虫POD活力

由图3可知：在菊芋花提取物的处理下，黄褐天幕毛虫PPO酶活性在处理后12 h、24 h、48 h均被抑制，在72 h PPO酶活性表现为激活作用。在处理后12 h PPO酶活性为4.8 U/mg，与对照组酶活性10.98 U/mg相比，处理组酶活力下降了0.56倍。处理后24 h处理组PPO酶活性为7.69 U/mg，对照组为6.31 U/mg，相比对照组酶活力下降了0.18倍。处理后48 h处理组酶活相比对照组下降了0.05倍，酶活力分别为8.7 U/mg和8.26 U/mg。处理后72 h处理组酶活力相比对照组呈上升趋势，由7.35 U/mg上升到9.35 U/mg。

图3 黄褐天幕毛虫PPO活力

由图4可知：菊芋花提取物对黄褐天幕毛虫保护酶CAT酶活性在处理后12 h、48 h、72 h均呈激活作用，在12 h和48 h激活作用最明显。处理后12 h处理组的CAT酶活性相比对照组的75.72 U/mg上升了0.88倍，而处理后24 h处理组的CAT酶活性为113.01 U/mg，对照组酶活力为100.61 U/mg。处理后48 h处理组的CAT酶活力为141.78 U/mg，对照组为86.32 U/mg，相比酶活力提高了0.64倍。处理后72 h处理组酶活力同样被激活，但相比于对照组差异较小，酶活力分别为84.98 U/mg和93.58 U/mg。

图4 黄褐天幕毛虫CAT活力

由图5可知：菊芋花提取物对黄褐天幕毛虫解毒酶GST酶活性有显著抑制作用。处理12 h处理组GST酶活力为59.52 U/mg相比于对照组的95.97 U/mg，酶活力上升了0.61倍。在处理24 h处理组酶活力相比对照组的酶活力明显下降，由94.02 U/mg下降到69.52 U/mg降低了0.26倍。在处理后48 h与处理后12 h呈现同样的趋势，酶活力下降了0.33倍。在处理后72 h酶活仍处于下降趋势，但仅下降了0.06倍。

图5 黄褐天幕毛虫GST活力

2.3 蛋白质、碳水化合物、海藻糖含量的影响

蛋白质、碳水化合物、海藻糖是昆虫体内与能量代谢密切相关的物质，通过测定三种含量观察菊芋提取物影响黄褐天幕毛虫体内能量变化的情况。

由图6可知：在菊芋提取物的处理下，黄褐天幕毛虫蛋白质含量呈上升趋势，在处理48 h略有下降。在处理后12 h对照组的蛋白质含量为17.13 mg/g，处理组的蛋白质含量为33.9 mg/g，相比较对照组增加了0.97倍。处理后24 h蛋白质含量由33.2 mg/g增长到38.77 mg/g，增长了0.2倍。在处理后48 h蛋白质含量由上升趋势变为下降趋势，下降了0.23倍。处理72 h后蛋白质含量显著上升，对照组蛋白质含量为44.36 mg/g，处理组蛋白质含量为66.20 mg/g，相比对照组来说上升了0.49倍。

图6 黄褐天幕毛虫的蛋白质含量

由图7可知：经菊芋花提取物处理过后的黄褐天幕毛虫体内的碳水化合物含量在处理后12 h、24 h、48 h均呈降低趋势，在72 h为激活作用。在处理后12 h碳水化合物的含量下降了0.14倍，对照组为7.83 mg/g，处理组碳水化合物含量为6.71 mg/g。在24 h对照组和处理组较12 h相比碳水化合物呈上升趋势，但处理组的碳水化合物含量仍低于对照组，分别为16.85 mg/g和11.36 mg/g。处理后48 h的碳水化合物含量的变化趋势与24 h相似。处理后72 h处理组的碳水化合物含量呈现显著的上升，上升了0.1倍。通过观察四个处理时间可以看出，经菊芋花提取物处理后的黄褐天幕毛虫体内的碳水化合物含量整体呈上升的趋势。

图7 黄褐天幕毛虫的碳水化合物含量

由图8可知：处理组和对照组的黄褐天幕毛虫体内海藻糖含量均呈下降趋势，在菊芋花提取物的处理下，处理组的海藻糖含量相比对照组略有降低，而在处理后12 h海藻糖含量下降幅度最大，下降了0.41倍。处理后24 h的对照组和处理组相差较小，分别为0.29 mg/g和0.30 mg/g。处理后48 h对照组为0.33 mg/g，处理组为0.25 mg/g，降低了0.26倍。处理后72 h的海藻糖含量变化趋势与处理后48 h相似，对照组为0.22 mg/g，处理组为0.15 mg/g，下降了0.32倍。

图8 黄褐天幕毛虫的海藻糖含量

3 结论与讨论

在昆虫体内，存在两类重要的酶，即解毒酶和保护酶。解毒酶主要与昆虫对食物及杀虫剂的解毒有关，可帮助昆虫将有毒物质排出体外，以保证正常的生理生长，当昆虫受到外界影响时，解毒酶会发生作用。使用亚致死浓度为10的氧化乐果处理黄褐天幕毛虫，谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性呈先上升后下降的趋势[12]。同样在对人参茎叶皂苷对桃蚜(Myzuspersicae)的研究中发现，在处理48 h后对桃蚜体内的GST有明显的抑制作[13]。在本研究中，我们测得在20 mg/mL浓度的菊芋提取物处理下，黄褐天幕毛虫体内的GST活性与前任研究呈相同趋势，在处理12 h后，GST活性上升，说明解毒酶发挥作用，将不利于昆虫生长的外源有毒物质进行解毒。在处理24 h后GST活性下降，到72 h与对照组相比无明显变化。在昆虫体内存在三种重要的防御氧化损伤的保护酶，分别是过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)。当前对这三种保护酶做了大量的研究，高效百树菊酯、功夫菊酯及杀虫脲对分月扇舟蛾(Closteraanastomosis)幼虫体内的SOD活性均有一定的抑制作用[14]。本研究中发现，浓度为20 mg/mL的菊芋提取物在处理12 h后抑制了SOD的活性，24 h后对SOD有一定的激活作用，从48 h到72 h的处理过程中，同样是先抑制后激活的趋势，说明菊芋提取物对黄褐天幕毛虫体内SOD活性有一定的影响。通过对分月扇舟蛾体内CAT活性的研究可知，高效百树菊酯对其3龄幼虫体内的CAT活性有一定激活效应[14]。同样，高效氯氰菊酯对天幕毛虫的CAT活性也起到了激活的作用[15]。在本研究中，我们得到了除24 h CAT活性被抑制，在处理12 h、36 h、72 h CAT的活性均显著激活。昆虫体内的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶是维持昆虫体内自由基平衡的主要酶，说明菊芋提取物对黄褐天幕毛虫体内自由基平衡造成了一定程度的破坏。大量研究表明外源杀虫剂对昆虫体内POD的活性有激活作用，如多杀菌素处理黄褐天幕毛虫时，幼虫体内的POD活性明显增强[16]。在0.8 mg/mL棉酚和0.08 mg/mL芸香苷的处理下，绿盲蝽(Lyguslucorum)体内POD活性显著高于对照[17]。我们的研究结果显示在处理12 h POD活性被抑制，但从24 h到72 h，黄褐天幕毛虫体内的POD活性均显著增加。除以上几种酶，昆虫体内还有另一种重要的保护酶即多酚氧化酶(PPO)，多杀菌素和曲酸对甜菜夜蛾体内PPO活力均有显著的抑制作用[18]。本研究实验结果得出在菊芋提取物处理黄褐天幕毛虫前48 h，PPO活性始终被抑制，在处理72 h PPO被激活，说明菊芋提取物对黄褐天幕毛虫体内的PPO活性有一定的抑制效应。以上结果说明菊芋提取物能够有效干扰昆虫的解毒酶和保护酶系统，对黄褐天幕毛虫的防治有一定的效果。

碳水化合物是昆虫维持生存的重要能量来源。在重金属的胁迫下，舞毒蛾(Lymantriadispar)幼虫体内的碳水化合物含量下降[19]。本实验结果与上述研究一致，用20 mg/mL菊芋提取物处理后，在处理的前36 h黄褐天幕毛虫体内的碳水化合物含量呈下降趋势，说明菊芋提取物抑制了幼虫体内碳水化合物的转化，对其生命状态有一定的影响。蛋白质是昆虫体内重要的营养物质，其变化体现了昆虫蛋白质的合成情况。在酸碱胁迫下，舞毒蛾幼虫体内蛋白质含量显著下降[11]。但在本研究中，除处理36 h，其他时间点的蛋白质含量均高于对照组，说明黄褐天幕毛虫体内蛋白质在菊芋提取物的作用下，形成了明显的应激反应，说明菊芋提取物对黄褐天幕毛虫体内蛋白质合成有一定的诱导作用。海藻糖是昆虫体内重要的糖类之一，实验结果表明黄褐天幕毛虫体内的海藻糖含量显著下降，说明菊芋提取物促使黄褐天幕毛虫体内的海藻糖分解为葡萄糖，以维持正常生理需要。

综上，浓度为20 mg/mL的菊芋提取物对黄褐天幕毛虫体内解毒酶和保护酶系统有一定的干扰。在处理初期，四种保护酶均呈下降趋势，而解毒酶GST的活性则表现为别激活，在处理末期，四种保护酶活性被显著激活，而解毒酶GST明显被抑制。除此之外，菊芋提取物对黄褐天幕毛虫体内蛋白质的合成也起到了诱导的作用，除处理48 h，其他时间点蛋白质含量均有所升高。由研究结果可知，菊芋提取物还抑制了黄褐天幕毛虫体内碳水化合物的转化，在处理过程中，提高了其体内碳水化合物的消耗，对其生命活动造成影响，且幼虫体内的海藻糖在菊芋提取物的作用下，被转化为葡萄糖，为昆虫的生长发育提供营养。