循环肿瘤DNA与原发性肝癌的临床相关性分析

杨忠霞 丁方回 张伟 蒋妮 毛小荣

原发性肝癌(PLC)是目前我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因[1-2]，早期不易诊断，大部分患者发现时已处于中晚期，失去手术治疗机会。由于PLC存在较高的复发转移风险，患者5年生存率不到12%[3]。研究发现，磷脂酰肌醇蛋白多糖3(GPC3)蛋白、信使RNA(mRNA)与PLC的诊断及预后具有相关性，但收集更为方便、经济的GPC3-循环肿瘤DNA(ctDNA)是否对PLC诊断及病情评价具有价值尚不明确，本研究旨在探讨GPC3-ctDNA对PLC诊断及病情评价的作用。

对象与方法

1.对象：选取2017年9月～2018年9月于我院感染科住院治疗的PLC患者80例(PLC组)，PLC诊断符合《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》中的诊断标准，其中男59例，女21例，年龄26～68岁，平均年龄(56.6±11.2)岁。68例(85%)患者有肝硬化病史。选择同期就诊于我院的肝硬化患者30例(肝硬化组)，肝硬化诊断符合2019年我国《肝硬化诊治指南》中的诊断标准并排除合并肝癌者，其中男18例，女12例，年龄18～65岁，平均年龄(51.3±11.2)岁；慢性肝炎患者30例(慢性肝炎组)，慢性肝炎诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》诊断标准并排除合并肝癌者，其中男16例，女14例；年龄25～58岁，平均年龄(31.5±6.8)岁。选取健康体检者(否认既往慢性肝炎等其他疾病史)30例作为正常组，其中男17例，女13例，年龄23～67岁，平均年龄(52.6±12.0)岁。4组患者在年龄、性别构成及3组肝脏疾病患者的病因构成比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。本研究经兰州大学第一医院伦理委员会审核批准[LDYYLL2020-04号]，受试者均知情同意。

表1 PLC组、肝硬化组和慢性肝炎组患者病因分布[例，(%)]

2.方法

(1)临床资料收集：观察PLC组患者入组时的体力、神志情况。经上腹部CT或MRI检查后，收集PLC患者的癌结节数目、肿瘤最大直径、门静脉癌栓情况及腹腔积液状况。

(2)实验室检查：所有入组者采集空腹静脉血 3 ml置于乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝采血管中，4 ℃下以2 000 r/min离心10 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存。所有PLC患者入组时均留取空腹静脉血(留取血标本前均未行手术、介入及靶向治疗等抗肿瘤治疗)，检测ALT、AST、总胆红素(TBil)、白蛋白、凝血酶原时间(PT)、甲胎蛋白(AFP)等。

(3)循环游离DNA(cfDNA)分离和提纯：采用血液微量基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取血浆cfDNA，为减少误差，所有标本用同一批号试剂盒，操作按照说明书进行，将提取的溶液储存于-20 ℃备用。

(4)实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测ctDNA含量：通过生物合成人GPC3 DNA序列作为标准品(上海吉玛制药技术有限公司)，然后将该序列片段克隆到质粒pUC57中，经过验证后纯化并提取DNA作为本研究标准品。血浆GPC3-ctDNA含量通过实时荧光定量PCR检测(上海吉玛制药技术有限公司)。GPC3基因上游引物：5’-GGAGCAAGACGTGACCTGAA-3’；下游引物：5’-CGGCCACAGTCCTTACTGAA-3’。

结 果

1.PLC组患者的临床特征：55%的PLC患者AFP<400 μg/L，体力活动状态(ECOG PS评分)为0～2分；肿瘤结节为多发(数目≥2个)，肿瘤直径>3 cm，肝功能Child-Pugh分级为A/B级。9例患者发生肝外转移，其中8例腹腔淋巴结转移，1例骨骼转移。见表2。

表2 80例PLC组患者临床特征

2.GPC3-ctDNA定量分析结果：PLC组、肝硬化组、慢性肝炎组、正常组ctDNA含量分别为(100.95±85.16)copies/μl、(34.12±14.01)copies/μl、(28.60±5.55)copies/μl、(25.40±8.53)copies/μl。PLC组明显高于肝硬化组、慢性肝炎组和正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)；肝硬化组、慢性肝炎组与正常组两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

3.GPC3-ctDNA用于PLC诊断的敏感性和特异性分析：ROC曲线分析结果显示，ctDNA单独诊断PLC的ROC曲线下面积(AUC)为0.737(95%CI0.561～0.913)，约登指数最大为0.63，对应的特异性是84%，敏感性是63%。AFP单独诊断PLC的AUC为0.725(95%CI0.613～0.958)，约登指数最大为0.58，对应的特异性是73%，敏感性是82%。ctDNA联合AFP诊断PLC的AUC为0.861(95%CI0.718～1.000)，约登指数最大为0.65，对应的特异性是94%，敏感性80%。

4.不同临床特征PLC患者GPC3-ctDNA水平比较：PLC组中肿瘤直径>3 cm且发生门静脉癌栓的患者ctDNA水平较肿瘤直径≤3 cm且无门静脉癌栓的患者高(P<0.05)。BCLC进展期及终末期患者ctDNA水平较早中期患者高(P<0.05)。不同年龄、性别、Child-pugh分级的PLC患者ctDNA水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同临床特征PLC患者GPC3-ctDNA水平比较

讨 论

PLC恶性程度高，预后差，早期诊断、早期治疗、密切监测病情变化对改善预后具有重要价值。AFP是目前PLC临床诊断及病情评价常用的血液标志物，但敏感性和特异性仍较低[4-5]。肝脏穿刺活组织检查由于其有创性及受到基础肝病的限制，不易在临床常规、反复应用[6]。目前，AFP与其他指标联合检测被认为有望提高PLC的早期诊断率[7]。

ctDNA是存在于肿瘤患者外周血液中的DNA片段，携带有肿瘤遗传信息。研究表明，多种肿瘤患者的血浆中可检测到ctDNA[8-9]。GPC3表达与PLC的发生、发展和预后密切相关，研究表明PLC癌组织中GPC3蛋白高表达，而在正常肝组织中不表达或低表达[10-11]，因此，本研究以GPC3基因作为检测ctDNA的靶基因。而GPC3-ctDNA是否能够帮助诊断疾病尚不明确，本研究分别对PLC、肝硬化、慢性肝炎及正常人群外周血中GPC3-ctDNA水平进行检测发现，PLC患者外周血中GPC3-ctDNA水平显著升高，提示GPC3-ctDNA具有成为诊断PLC生物标志物的潜力。本研究中ROC曲线分析结果显示，相较于单一ctDNA定量或单一AFP检测，GPC3-ctDNA联合AFP可以提高对PLC的诊断效能。

PLC易发生门静脉侵犯、腹腔淋巴结转移及远处转移，预后差。其中门静脉侵犯是临床中最多见的PLC进展形式。除了在诊断方面的价值外，ctDNA在病情严重程度和疾病进展方面也有重要意义。Ren等[12]对79例PLC患者、20例肝硬化但无PLC患者和20例正常对照者进行研究发现，ctDNA水平与肿瘤大小及TNM分期相关，且与3年无病生存率和总生存率呈负相关。本研究得到了相似的结果，发现当肿瘤发生门静脉侵犯时，GPC3-ctDNA水平明显升高；且BCLC分期为进展期和终末期的患者GPC3-ctDNA水平明显高于早中期患者。因此ctDNA有望用于PLC病情及疾病进展的评估。

综上所述，PLC患者外周血液中可检测到ctDNA，联合AFP在诊断PLC中具有较高的敏感性及特异性，且ctDNA水平与肿瘤进展具有相关性，能够帮助优化PLC的临床管理。