miR-381、HMGB1、NGAL与食管癌病理特征相关性研究

张俊，杨彩丰，张丽秋，姜登鸽，赵鹏，孙祥云

食管癌是由于食管鳞状上皮异常分化引发的癌症，分为不典型增生、原位癌、浸润癌［1］。食管癌是最常见的第八大恶性肿瘤，全球每年新增病例高达100万例，死亡病例约30万，以40岁以上男性为主［2-3］。我国是世界上食管癌发病率及死亡率最高的国家，每年新发病例约占全球1／2以上，每年约有16～20万人死于食管癌［4-5］。随着医疗技术的发展，食管癌患者5年生存率明显升高趋势，但手术切除食管癌的疗效并未出现进一步提升［6］，多名学者从分子机制方面对该现象进行了分析，认为部分特异性因子可能在食管癌的发生发展中起到了重要作用［7］，这为食管癌的靶向治疗提供了新方向。微小 MRA-381（miRNA-381，miR-381）是肿瘤抑制miRNA的一种，以往的研究表明miR-381在乳腺癌、卵巢癌、肾癌等肿瘤组织中呈现低表达态［8］。血清高迁移率族蛋白-1（serum high mobility group protein-1，HMGB-1）属于高迁移率族蛋白成员之一，具有诱导趋化因子、细胞因子产生的作用［9］，近几年还有研究发现HMGB1在DNA复制、转录、重组和修复等多种重要核内生物学进程中发挥作用［10］。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophilgelatinase associatedlipocalin，NGAL）是Lipocalin家族成员之一，是一种在中性粒细胞中存在的糖蛋白，研究指出NGAL可以通过调节基质金属蛋白酶9的活性，参与肿瘤的发生发展尤其是肿瘤的浸润转移等过程［11-12］。虽然上述研究已证实miR-381、HMGB1和NGAL与肿瘤细胞的增殖转移相关，但关于上述因子对肿瘤诊断价值的研究尚处于缺乏状态，将癌组织与癌旁组织进行对比分析，探究miR-381、HMGB1和NGAL在食管癌中的临床检测意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019年5月至2021年4月我院行食管癌根治术手术治疗的40例患者的食管癌及癌旁组织。入组患者中男性23例，女性17例，年龄47～70岁，平均年龄（61.28±4.33）岁，平均体重（70.19±4.30）kg。

纳入标准：①患者经胃镜及病理组织诊断确诊为食管癌（均为上段病变）；②能够配合进行调研；③病历资料齐全；④患者及其家属对本次调研过程、方法、原理清楚明白并签署知情同意书，并且经过医学伦理委员批准同意（20210530）。排除标准：①合并精神疾患者；②合并严重肝肾功能障碍者；③合并全身感染性疾病者；④并发其他恶性肿瘤者。

1.2 检测方法

将采集的食管癌组织及癌旁组织（均为上段食管上皮组织）使用10%福尔马林固定后石蜡包埋，做连续4μm切片，而后选择RT-PCR试剂盒（购自美国ABI公司）、人HMGB1试剂盒（购自上海研启生物科技有限公司）、NGAL试剂盒（购自上海研启生物科技有限公司）分别对上述三种因子水平进行检测，检测严格按照试剂盒说明书进行，每个指标均连续检测3次取平均值作为最终结果。

1.3 研究指标

①记录食管癌和癌旁组织中miR-381、HMGB1、NGAL表达水平；②收集记录食管癌患者临床特征诸如性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤位置、TNM分期、分化程度等，分析食管癌患者miR-381、HMGB1、NGAL水平与上述资料的相关性；③分析食管癌患者癌组织中miR-381、HMGB1、NGAL两两表达水平的相关性。

1.4 统计学方法

采用SPSS22.0统计软件处理数据满足正态分布的计量资料采用表示，组间差异使用t检验；非正态分布的计量资料采用M（Q1，Q3）描述，使用数检验中的Mann-Whitney U检验进行统计推断。计数资料采用频数或%表示，组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman秩相关系数。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-381表达及其与食管癌临床特征关系

食管癌组织中miR-381阳性表达率22.5%（9／40），癌旁组织miR-381阳性表达率60.0%（24／40），组间差异具有统计学意义（χ2=11.605，P=0.000），HE染色显示，相比于癌组织，癌旁组织染色明显更深，细胞核中出现棕红色或紫色细胞核数量明显更多（见图1）。

图1 miR-381在HE染色下癌旁组织阴性表达（A）和食管癌组织阳性表达（B）。癌旁组织染色明显较食管癌组织更为明显，染色更深。放大倍数为10倍

食管癌组织miR-381表达水平与食管癌的TNM分期、分化程度、浸润程度及淋巴结转移密切相关（P＜0.05），与患者的性别、年龄、肿瘤直径以及癌肿位置无明显关系（P＞0.05），见表1。

表1 miR-381表达与食管癌临床特征关系分析（）

表1 miR-381表达与食管癌临床特征关系分析（）

2.2 HMGB1表达及其与食管癌临床特征关系

食管癌组织中HMGB1阳性表达率67.5%（27／40），癌旁组织HMGB1阳性表达率25.0%（10／40），组间差异具有统计学意义（χ2=14.532，P=0.000），HE染色显示，食管癌组织中出现黄染的细胞数目明显大于癌旁组织，同时食管癌组织染色颜色深度也较癌旁组织更深（见图2）。HMGB1表达水平同食管癌的TNM分期、分化程度及淋巴结转移密切相关（P＜0.05），与患者的性别、年龄、肿瘤直径、癌肿位置、浸润程度无明显关系（P＞0.05），见表2。

表2 HMGB1表达与食管癌临床特征关系分析（）

表2 HMGB1表达与食管癌临床特征关系分析（）

图2 HMGB1在HE染色下癌旁组织阴性表达（C）和食管癌组织阳性表达（D）。放大倍数10倍，食管癌组织染色深度明显大于癌旁组织。

2.3 NGAL表达及其与食管癌临床特征关系

食管癌组织中NGAL阳性表达率62.5%（25／40），癌旁组织HMGB1阳性表达率20.0%（8／40），组间差异具有统计学意义（χ2=14.907，P=0.000），染色结果显示，食管癌组织中阳性表达细胞数目明显大于癌旁组织，同时食管癌组织中被染色的细胞颜色深度也明显高于癌旁组织（见图3）；NGAL表达水平同食管癌的TNM分期、分化程度、浸润程度、淋巴结转移关系密切（P＜0.05），与食管癌患者的性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤位置无明显相关（P＞0.05）。见表3。

表3 NGAL表达与食管癌临床特征关系分析（）

表3 NGAL表达与食管癌临床特征关系分析（）

图3 NGAL在HE染色下癌旁组织阴性表达（E）和食管癌组织阳性表达（F）。癌组织染色强度明显大于癌旁组织，细胞核染色更为明显，且阳性细胞数更多。放大倍数10倍。

2.4 食管癌组织中miR-381、HMGB1与NGAL表达相关性

实施食管癌组织中miR-381表达与HMGB1、NGAL表达均呈现负相关（rs=-0.964、rs=-0.941 6，P＜0.000 1），见图4。

图4 食管癌组织中miR-381、HMGB1与NGAL表达相关性分析

3 讨论

食管癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，该症在全球均有发病，但发病率在不同地区和种族中有一定差异［13］。中国是食管癌高发国家之一，全球约有50%以上的食管癌发生于华人中，国内河南、河北、山西、山西、湖北等地均为食管癌的高发地区［14］，国内一项针对河南临县开展的流调学数据显示，食管癌发病率约为478.9／10万［15］。同时食管癌在国内恶性肿瘤死亡率中排位靠前，一项针对全国27省开展的抽样调查显示，食管癌死亡率约为17.38／10万，占恶性肿瘤全部死亡原因构成的16.41%，仅次于胃癌、肝癌和肺癌［16］。近些年食管癌的诊疗方式有了显著进步，这一定程度上影响了食管癌患者的生存率，随着近几年对食管癌分子机制方面研究的深入，以血管内皮因子抑制剂为代表的新一代靶向治疗成为现代肿瘤治疗学的前沿方向［17］，为食管癌的诊治提供了新的思路和举措。

本研究通过设立对照分组的方式，就miR-381、HMGB1、NGAL在食管癌中的临床检测价值进行了探究，结果显示，将食管癌组织同癌旁组织相比较，食管癌组织中miR-381呈现低表达态，HMGB1和NGAL均呈现高表达态，差异明显。miR-381属于微小RNA的一种，微小RNA是一类具有强大调控基因表达能力的单链RNA，虽然microRNA不直接编码蛋白质，但miRNA能够通过靶向影响某些RNA表达来影响特定蛋白质的表达，进而发挥机体代谢调控作用［18］。已有研究证实，肾癌中miR-381呈现明显的低表达态，而过表达的miR-381可以降低肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，其机制可能与miR-381能够下调DNA结合抑制因子1表达有关［19］。还有研究认为，miR-381的表达下降会促进结肠癌的增殖与侵袭，可以考虑将miR-381作为结肠癌治疗的新靶标［20］。本文作者分析认为，miR-381属于肿瘤抑制miRNA，其表达失衡会促进恶性肿瘤的发生与发展，这与其他学者的研究结果相一致，文中为进一步论证该结果，还分析了miR-381表达水平同食管癌病理特征的相关性，结果显示，miR-381表达水平与食管癌的TNM分期、分化程度、浸润程度及淋巴结转移密切相关。学者杨泽波［20］等的研究与本结果类似，该学者认为其原因与miR-381广泛参与了胃癌的发生发展进程有关，胃癌患者TNM分期越高、分化程度越低、浸润程度越大，以及出现淋巴结转移都代表病情恶化较为严重，因而miR-381表达水平会相对更高，而年龄、性别、肿瘤直径等与临床病例特征无关则提示miR-381表达不易受个体因素影响。

HMGB1最早于1973年被在牛胸腺细胞中提取，因其在电泳时具有较高的迁移率，因而被命名为高迁移率蛋白。已有的研究证实，HMGB1广泛参与了机体多种功能的调控，当个体受到外界刺激后，机体的巨噬细胞、树枝状细胞等会释放HMGB1到细胞外，从而诱导趋化因子和细胞因子产生，该机制可能也同多种肿瘤的发生发展相关［21］。本研究的结果显示，食管癌组织中HMGB1表达水平明显较癌旁组织高，分析其原因可能与肿瘤组织具有特殊的生物活性，其不间断的分裂和增殖使带有肿瘤特性的细胞大量出现，从而导致引起异常基因表达或正常基因表达的蛋白量增加有关。而进一步的分析发现，HMGB1表达水平同食管癌的TNM分期、分化程度及淋巴结转移密切相关，这可能与HMGB1一方面可以促进多种炎症细胞因子分泌，另一方面可以促进肿瘤旁新生血管形成有关，该结果提示HMGB1的水平也一定程度上可以反映食管癌病理进程，为食管癌的诊疗提供了新的思路。

NGAL蛋白是Lipocalin蛋白家族的一员，该蛋白在人体绝大多数正常组织中均有不同程度的表达，已有的研究推测NGAL的表达可能与表达器官的无菌状态有关，而在表达器官发生炎症病变时，NGAL水平就会显著升高，因而目前NGAL已经作为炎症性疾病的新标志物被应用于临床，在诸如肺气肿、哮喘患者的痰液中，NGAL均呈现高表达态［23］。近些年的研究发现，NGAL除了会介导炎症进程外，还在其他多种细胞中被诱导表达，从而在多个层面上影响着细胞的行为，陈洈伟［24］等的研究指出子宫内膜癌患者血清中NGAL呈现高表达态，可考虑将其作为疾病诊断和手术疗效判断的标志物，具有较高的准确性，学者王厚东［25］等的研究则指出，siRNA可以通过抑制NGAL基因及其蛋白的表达来抑制结肠癌细胞的迁移，从而加速肿瘤细胞凋亡。本研究结果证实，NGAL的表达同食管癌的病理密切相关，这也为食管癌的鉴别诊断甚至预后分析提供了新的参考。

综上所述，miR-381在食管癌中呈现低表达态，HMGB1和NGAL呈现高表达态，且上述因子与食管癌的临床病理特征具有一定的关联，提示上述因子在食管癌的发生发展中可能发挥重要作用，可以考虑将其应用于食管癌的诊断鉴别中。