单叶刺槐半同胞子代叶片的滞尘能力及叶表SEM特征分析*

徐立人，刘宠，张军，柳俊明，王立成，李清泉，杨敏生，李彦慧

(1.河北农业大学 园林与旅游学院，河北 保定 071000；2.河北农业大学 林学院，河北 保定 071000；3.河北省保定市满城区苗圃场，河北 保定 071000)

大气污染已成为目前最受关注、最为严重的生态问题，而空气颗粒物是大气的首要污染物，其中含有的大量重金属元素及其他有害成分严重影响了人类健康及生活质量[1]。空气颗粒物中直径小于等于10 μm(PM10)的颗粒物，由于其可以直接进入呼吸道，称为可吸入颗粒物。其中粒径小于等于2.5 μm(PM2.5)的微粒，由于其附着能力强，表面积大，可携带大量细菌、病毒直接进入人体血液循环中，引发大量疾病，对人类健康的危害极大[2-4]。

刺槐(RobiniapseudoaciaL.)，又名洋槐，属豆科(Leguminosae)刺槐属(RobiniaLinn)多年生落叶乔木。其萌芽性强、根系发达、耐干旱、生长迅速、适应性强，是水土保持、防风固沙、土壤改良、园林绿化及提供蜜源和饲料的优良树种，现已成为我国北方优良的水土保持树种[5-7]。单叶刺槐(Robiniapseudoacaciaf.unifolia)是刺槐的变种，主要特征是复叶仅有一个或几个小叶片，叶片的长宽明显大于普通刺槐。2004年从德国引进了单叶刺槐无性系，发现其与普通刺槐混栽，可产生种子，半同胞家系中复叶的小叶数、叶面积等发生明显的变异[8]。目前，对园林绿化树种滞尘能力的研究主要集中在不同树种之间的纵向对比，且大多针对的为单一滞尘指标，尚无对同树种不同无性系滞尘能力的研究[9-12]，对单叶刺槐及其半同胞子代的研究也仅限于组培体系的建立[13]和子代SSR鉴定[8]等。

本试验以单叶刺槐及6个半同胞子代无性系5月的当年生叶片为材料，测定其单位面积总滞尘量，同时运用Mastersizer 2000仪器测定其粒径分布，利用扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope，SEM)扫描各样本叶表面图像，比较各无性系对不同粒径尘土吸附量的差异，探讨单叶刺槐吸附尘土的机理及影响因素，采用隶属函数法、聚类分析法对各无性系的滞尘能力进行综合评价，以期为今后单叶刺槐在园林中的合理应用及遗传改良、新品种选育提供重要的理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验地保定市满城区苗圃场位于河北省保定市满城区南韩村镇，属温带大陆性季风气候，夏季高温多雨，冬季寒冷干燥，四季分明。根据2019年保定市环境质量公报，全市空气质量一级达标天数仅为30 d，PM2.5年均浓度为58 μg/m3，满城区的空气质量近年来在保定市22个县(市、区)中，始终位列倒数前5名，而本试验地所处的满城区南韩村镇在全市236个乡镇中，空气质量排名也较为靠后。

2019年5月5日选取单叶刺槐母本及已通过SSR分子鉴定的26个子代，嫁接在定植于保定市满城区苗圃场的2 a生普通刺槐上，形成27个无性系，每个无性系嫁接20株，选取母本及6个叶形产生明显变异的子代的当年生叶片为试验材料(表1)。

表1 各参试无性系的叶形特征Tab.1 Leaf shape characteristics of all clones

1.1.1 叶表颗粒物测定及粒度分析

于2020年5月进行3次采样(每次采样的前7 d无降雨且风速小于5级)，在选定的7个无性系中，每个无性系选择生长状况良好、长势一致的5株(5个重复)进行采样。考虑到高度对叶片滞尘能力的影响，分东、南、西、北4个方向，上、中、下3层均匀采集50 g左右的健康叶片，封存于PE自封袋内带回实验室进行测定，每个重复平行测定3次，实验过程中佩戴PE手套，尽可能避免样品灰尘脱落及受到污染。

1.1.2 叶表SEM特征分析

2020年5月19日，在选定的样树上摘取健康完整的叶片，封存于充气的PE自封袋(避免叶片因受到挤压而导致表皮毛受损)，带回实验室分析。

1.2 研究方法

1.2.1 叶表滞留颗粒物质量测定方法

参考洪秀玲等[14]的方法并作适当改进，将采集的叶片用去离子水冲洗的同时用软毛刷轻刷上下叶表，之后称悬浊液质量(MT)。用恒温磁力搅拌器搅拌悬浊液5 min，使悬浊液中的颗粒均匀分布，取30 mL左右的悬浊液于培养皿中，称质量(Mp)。将培养皿置于60℃烘箱中，烘干后称质量(mp)，叶表滞留颗粒物质量(M)如下：

①

1.2.2 叶面积计算方法

参考张桐等[10]的方法并作优化，将叶片铺于纯白A4纸上，使用惠普公司生产的 Scanjet 200型扫描仪扫描并保存图片，使用Adobe Photoshop CS5软件对叶面积进行测定。首先新建画布，参数设置为国际标准纸张(长为297 mm，宽为210 mm)，将扫描得到的叶片图片导入画布，利用软件自带的魔棒及油漆桶工具，将图片底色调为纯白(RGB参数均为255)，将叶片颜色调为纯黑(RGB参数均为0)，使用直方图工具获得纯黑部分百分比。叶片双面面积计算公式如下：

叶片双面面积=纯黑部分百分比×A4纸张面积×2 ②

1.2.3 叶表颗粒物粒径分布测定

将采集到的叶片使用ddH2O清洗，方法同1.2.1，抽取30 mL悬浊液，封装于50 mLPE离心管，超声震荡后使用马尔文公司生产的Mastersizer 2000激光粒度仪对悬浊液进行粒径分析。

1.2.4 叶表SEM特征观察

将1.2.3中已洗净的叶片，使用圆孔打孔器(0.5 mm)在叶片边缘、叶脉两侧打孔，将得到的圆片参考张俊叶等[11]的方法进行前处理、冷冻干燥、粘台镀金，之后使用日立公司生产的SU8100冷场扫描电镜观察拍照。

1.2.5 数据处理与分析

采用SPSS 25.0和Excel 2016软件对试验数据进行有效性检验、单因素方差分析(Duncan法)、聚类分析、相关性分析，并绘制图表。

参考郭燕等[15]的方法，进一步利用隶属函数法，计算各滞尘指标隶属度，以各样本、各指标的隶属度均值作为滞尘能力的综合评价标准，聚类分析，对全部样本的滞尘能力进行排序、分类及综合评价。各滞尘指标隶属度计算公式如下：

Uij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

③

式中：Uij表示编号为i的样本j指标的隶属函数值，Xij表示编号为i的样本j指标的测定值，Xjmin表示所有样本j指标的最小值，Xjmax表示所有样本j指标的最大值，i表示某个编号样本，j表示某一指标。

2 材料与方法

2.1 单叶刺槐及各半同胞子代叶表滞尘能力

2.1.1 滞留总颗粒物的能力

叶片的单位叶面积滞留量体现了植物对空气中总颗粒物的滞留能力。

由图1可知，各编号无性系的单位叶面积滞留量在39.50～76.32 μg/cm2之间，其中子代B24-3、C24-2、B23-1、C24-1、C23-1的单位叶面积滞留量分别比母本提高了51%、5%、90%、63%、65%；与母本相比，B24-3、B23-1、C24-1、C23-1差异显著，C24-2不显著。子代A20-5的单位叶面积滞留量比母本降低了2%，与母本相比无显著差异。说明对滞留空气中总颗粒物的能力而言，大多数子代优于母本。

图1 单叶刺槐母本及不同子代总颗粒物滞留能力注：不同小写字母表示在0.05水平差异显著，下同。Fig.1 Capture capacities of particulate matters retained by plant leaves of R.pseudoacacia f.unifolia female parent and different progenies

变异系数反映了叶片滞尘能力的稳定度，7个无性系的变异系数在6%～28%区间内，均低于30%，说明各参试无性系对空气中总颗粒物的滞留能力均较为稳定。

2.1.2 叶表滞留颗粒物粒径分析

(1)叶表PM2.5吸附能力对比 空气中的PM2.5(D≤2.5μm)微粒，可通过人类口鼻吸入到细支气管和肺泡，直接影响肺的通气功能，使机体易处在缺氧状态。由叶表滞留颗粒物PM2.5百分比的测定结果可知(图2-A)，子代B23-1、C24-1分别比母本提高7%、15%。与母本相比，C24-1差异显著，B23-1差异不显著，子代A20-5、B24-3、C24-2、C23-1分别比母本降低60%、25%、17%、50%，与母本相比均差异显著。说明就改善大气PM2.5污染的角度而言，C24-1最优，但大多数子代吸附PM2.5的能力不及母本。

图2 单叶刺槐母本及不同子代叶片滞留颗粒物粒径分析注：不同小写字母表示在0.05水平差异显著，下同。Fig.2 Particle size analysis by plant leaves of R.pseudoacacia f.unifolia female parent and different progenies

(2)叶表PM2.5-10吸附能力对比 空气中PM2.5-10(2.5μm

(3)叶表PM>10吸附能力对比 空气中PM>10(D>10μm)微粒，在人体呼吸时通常会被鼻腔和咽喉所阻滞，产生不适感，但并不入肺，对人体的危害程度相对较低。由叶表滞留颗粒物PM>10百分比的测定结果可知(图2-C),子代A20-5、B23-1、C24-1分别比母本提高7%、1%、2%，与母本相比，差异均不显著。子代B24-3、C24-2、C23-1分别比母本降低32%、38%、23%，与母本相比均差异显著。说明母本及半数子代对于空气中PM>10微粒的吸附能力相对较强。

(4)叶表滞留颗粒物SSA对比 SSA(Specticic surface aera)，是供试材料叶表单位质量颗粒的表面积之和。SSA值越高，其吸附的有害物质量越大，从一定意义上看，环境效益也就越高。由各参试无性系SSA的测定结果可知(图2-D)，子代A20-5、C24-1分别比母本提高14%、31%，与母本相比，C24-1差异显著，A20-5差异不显著。子代B24-3、C24-2、B23-1、C23-1分别比母本降低27%、24%、25%、33%，与母本相比，C23-1差异显著，B24-3、C24-2、B23-1差异不显著。说明子代C24-1吸附有害物质的能力较强。

2.2 单叶刺槐及各半同胞子代叶表SEM特征分析

通过对上下叶表微观结构进行SEM特征分析，可以更详细地了解单叶刺槐半同胞子代与母本相比在叶表结构上产生的微米级变异。由图3可知，各样本间的叶面粗糙程度均有所差异，其中子代C24-1、B23-1的叶面粗糙程度与母本相比显著提高，且B23-1叶面存在瘤状突起。

图3 500倍SEM视野下各样本叶表微观结构注：图中字母与数字组合为各无性系的编号，上下分别表示叶片上表皮与下表皮。Fig.3 SEM of micro-configurations of leaf epidermis for R.pseudoacacia f.unifolia and its different hybrid progenies(500×)

进一步分析各样本的气孔器形态、气孔数量、表皮毛数量(表2)可知，各样本的气孔形状无较大差异，均为圆形，且排列均不整齐。从气孔大小来看，除子代B23-1、C23-1外，母本及其余子代的气孔大小均不统一。从气孔的开闭程度来看，各样本间均存在差异，其中子代C24-1的气孔几乎均开放，但A20-5、B24-3、B23-1的气孔几乎均关闭。从气孔数量来看，母本与其余样本相比，气孔数量最多，且少部分保卫细胞存在突起。母本及各子代叶表均有表皮毛，但密度存在差异，其中B23-1的表皮毛数量最多，在500倍视野下为8根，母本、子代B24-3及C24-2表皮毛数量最少，均为1根。

表2 各样本叶表皮气孔及表皮毛特征(500倍视野下)Tab.2 The characteristics of leaf epidermis stomata and epidermis of all clones tested(500×)

2.3 叶形及叶表SEM特征与滞尘指标的关系

为进一步探讨单叶刺槐及各半同胞子代的叶表滞尘机制，将叶形及叶表SEM指标、各滞尘指标的原始数据经无量纲化处理后，进行相关性分析，筛选与滞尘能力显著相关的叶形、SEM指标(表3)。结果表明小叶面积与单位叶面积总滞尘量呈显著正相关(r=0.816)，说明小叶面积越大，各样本对空气中总颗粒物的滞留能力越强。气孔的开闭程度与PM2.5的滞留能力呈极显著正相关(r=0.957)，说明气孔的开放程度越高，对于空气中PM2.5的滞留效果也就越好。表皮毛数量与单位叶面积总滞尘量呈显著正相关(r=0.847)，与PM2.5的滞留能力呈极显著正相关(r=0.978)，说明表皮毛的密度显著影响了各样本对空气中总颗粒物及PM2.5的滞留效果。叶面粗糙程度与单位叶面积总滞尘量极显著正相关(r=0.923)，与其余滞尘指标均呈显著正相关，说明叶面粗糙程度对叶表滞尘能力的影响最大，且叶面越粗糙，滞尘能力越强。

表3 叶形及叶表SEM特征与各滞尘指标的关系Tab.3 Relationship between leaf shape and SEM characteristics of leaf surface and dust retention indexes

2.4 滞尘能力综合评价

依据单一滞尘指标无法客观全面的反映样本滞尘能力的强弱，运用隶属函数法，以5个滞尘指标及与其相关性显著的叶形指标(除气孔开闭程度指标，因为此指标受光照、温度等因素影响较大)的标准化数据为依据，计算各指标的隶属度，并求各样本的隶属度均值，均值越大，其叶表滞尘能力越强。如表4所示，7个样本按综合滞尘能力强弱排序为：B23-1、C24-1、A1-1、A20-5、C23-1、C24-2、B24-3。

表4 各样本滞尘指标隶属度值Tab.4 Membership value of dust retention index of each sample

进一步以各样本的隶属度均值为依据进行聚类分析(图4)，当类间最短距离为5时，可按滞尘能力强弱将全部样本分为4类，第I类为B23-1，滞尘能力强；第Ⅱ类为C24-1，滞尘能力较强；第Ⅲ类包括A1-1、A20-5、C23-1、C24-2，滞尘能力中等；第Ⅳ类为B24-3，滞尘能力相对较差。

图4 单叶刺槐及其不同子代滞尘能力聚类分析注：图中字母与数字组合为各无性系的编号。Fig.4 Cluster analysis of dust retention ability of R.pseudoacacia f.unifolia and its different hybrid progenies

3 讨论与结论

根据近5 a的河北省环境质量公报，本试验所在的河北省保定市全年环境空气质量达国家二级标准的天数不足60%，空气污染程度始终位列全国前十名，虽达标天数逐年增加，但空气质量状况仍不容乐观。而植物叶片对大气颗粒污染物有明显的滞留效果，不同树种间的滞尘能力可达40倍以上[16-18]。因此合理选择滞尘树种，对改善空气质量，提高人民的幸福感具有重要意义。

本研究表明，供试无性系的单位叶面积总颗粒物滞留量均值为55.85 μg/cm2，高于大叶黄杨(Buxusmegistophylla)、白蜡(Fraxinuschinensis)、元宝枫(Acertruncatum)等北方常见绿化树种[10]，说明单叶刺槐的整体滞尘能力较为优秀。原因可能是由于树种间叶表微观结构存在差异，单叶刺槐各参试无性系的叶表均有表皮毛结构，提高了单叶刺槐单位叶面积对颗粒物的滞留量，而上述树种均无此叶表结构，也有可能是由于采样月份、采样地域的空气质量状况不同所导致。运用激光粒度仪对总颗粒物进行粒度分析，结果表明各样本吸附的颗粒物粒径主要分布在PM10(D≤10μm)以内，各样本滞留PM2.5、PM2.5-10、PM>10的能力存在差异。这与Wang等[19]、Tomaevi等[20]的研究结论一致，与张桐等[10]得出的北京市6种植物叶表滞留颗粒物粒径主要分布在10～50 μm的结论不同，原因可能是由于树种之间存在差异，也有可能是由于采样时间的不同导致的。运用SEM法观察各样本的叶表微观特征，结果表明部分子代在微观结构上与母本相比产生了明显变异，这也进一步体现了在杂交育种的过程中微观结构的性状分离[21]。将各叶形及SEM指标与滞尘指标进行关联分析，结果表明小叶面积、表皮毛数量与单位叶面积总滞尘量显著相关，气孔的开闭程度、表皮毛数量与PM2.5的滞留能力显著相关，叶面粗糙程度与各滞尘指标均显著相关，从微观角度解释了各样本间滞尘指标存在差异的原因。这与张俊叶等[11]、鲁绍伟等[22]众多学者的研究结论相似，与王琴等[9]对武汉市15种绿化植物滞尘能力研究得出的气孔大小与滞尘能力无关的结论不同，原因可能是气孔开放程度越大，细小的颗粒物越容易吸附在气孔内壁，也有可能是两地气候条件的不同或树种的不同导致的。进一步利用隶属函数法、聚类分析法对7个样本的滞尘能力进行综合评价，结果表明仅子代B23-1、C24-1的综合滞尘能力优于母本，原因可能是由于本试验材料为2019年嫁接，生长时间仅1 a，部分优势性状还未完全体现。

本研究表明，单叶刺槐及各子代的滞尘能力较为优秀，可作为园林滞尘树种在我国北方大规模推广。利用叶形及SEM指标，可对样本间滞尘能力的差异作出有效解释。子代B23-1的滞尘能力最强，C24-1对PM2.5的吸附能力最强，A20-5对PM2.5-10及PM>10的吸附能力最强，但大部分子代的杂种优势并未完全体现，还有待进一步培育优化。