雷公藤甲素减轻MRL/lpr狼疮小鼠肾损伤的作用机制研究
2021-02-24段然吴沅皞刘维
段然,吴沅皞,刘维
(天津中医药大学第一附属医院 风湿免疫科,天津300193)
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是临床常见的自身免疫性疾病,以自身免疫应答紊乱、产生自身抗体异常并与相应自身抗原形成免疫复合物为特征,可累及全身多个脏器并引起相应的临床表现[1]。肾脏是SLE 病情发展变化过程中常见的受累脏器,免疫复合物在肾脏沉积后引起狼疮肾炎(lupus nephritis,LN),LN 不仅是影响SLE 预后的重要因素,也是引起终末期肾脏病的常见原因,需要进行积极防治[2-3]。雷公藤甲素(Triptolide,TPL)是从中药雷公藤中提取到的环氧化二萜内酯化合物,具有免疫调节活性,在SLE、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的治疗中体现出一定价值[4],多项研究报道了TPL 对SLE 小鼠肾功能的保护作用[5-6],但具体的机制并未阐明。国内施栋梁等[7]关于SLE 的细胞实验证实,TPL 对γ 干扰素(Interferon-gamma,IFN-γ)诱导的肾小球细胞炎症具有缓解作用,且这一作用与抑制JAK1/STAT1 信号通路有关。基于此,本实验深入探究TPL 调控JAK1/STAT1 通路,减轻MRL/lpr狼疮小鼠肾损伤的作用及机制,旨在阐明TPL 用于LN防治的潜在价值及分子机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雌性C57BL/6 正常小鼠8 只及MRL/lpr 狼疮小鼠32 只购自苏州赛业模式生物研究中心,8~10 周龄、体重20~25 g。实验动物生产许可证号:SCXK(苏)2018-0003。
1.2 实验试剂与仪器
TPL 购自上海柘智生物科技公司,过表达JAK1 的腺病毒购自上海汉恒生物科技公司(浓度1×1011PFU/ml、-80℃保存),尿蛋白、血清肌酐(serum creatinine,Scr)、血尿素氮(blood urea,BUN)检测试剂盒购自南京建成研究所,免疫荧光染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,IgG、C3 抗体购自美国Abcam 公司,HE 染色试剂盒购、RIPA 裂解液及BCA 蛋白定量试剂盒购自北京索莱宝公司,γ 干扰素诱导蛋白-10(interferon-gamma induced protein 10, IP-10)、高迁移率族蛋白1(high mobility group box protein 1, HMGB1)酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购自上海酶联公司,JAK1、STAT1一抗购自德国CST 公司。正置显微镜购自日本Nikon 公司,多功能酶标仪购自美国Bio Tek 公司,电泳仪及凝胶成像仪购自上海天能公司。
1.3 方法
1.3.1 小鼠分组、模型复制及给药8 只C57BL/6 正常小鼠作为对照组;32只MRL/lpr狼疮小鼠随机分为模型组、TPL 组、JAK1 组、TPL+JAK1 组,每组8只。模型组给予生理盐水灌胃,连续9周;TPL 组给予0.125 mg/(kg·2 d)TPL 灌胃,连续9 周;JAK1 组给予JAK1 腺病毒悬液10 μl 单次尾静脉注射;TPL+JAK1 组给予0.125 mg/(kg·2 d)TPL 灌胃,连续9周,以及JAK1腺病毒悬液10 μl单次尾静脉注射。
1.3.2 尿蛋白及Scr、BUN 的检测末次灌胃后开始收集24 h 尿,然后处死小鼠收集血清,检测24 h尿蛋白及Scr、BUN 水平,按照试剂盒说明书进行操作,配置反应体系后在全自动生化分析仪上检测相应指标。
1.3.3 肾脏HE染色及免疫荧光染色处死小鼠后解剖双侧肾脏,左侧肾脏用4%多聚甲醛固定后进行石蜡包埋,制作病理切片后行HE 染色,在显微镜下观察肾脏的病理改变;另取肾脏病理切片行免疫荧光染色,IgG 和C3 一抗的稀释比例为1∶300,染色后用抗荧光猝灭封片液封片,显微镜下观察并计算免疫荧光强度。以上操作均按照试剂盒说明书进行。
1.3.4 血清及肾脏中IP-10、HMGB1 质量分数的检测取血清样本,采用ELISA 试剂盒检测IP-10、HMGB1 质量分数。取右侧肾脏组织,采用ELISA 试剂盒检测IP-10、HMGB1 质量分数,计算每毫克肾脏蛋白对应的IP-10、HMGB1 含量。以上操作均按照试剂盒说明书进行。
1.3.5 肾脏中JAK1、STAT1表达水平的检测取右侧肾脏组织,用RIPA 裂解液提取组织中的蛋白,将30 μg 蛋白样本加入SDS-PAGE 电泳后湿转至NC膜,5%脱脂牛奶室温封闭NC 膜1 h,用1∶2 000稀释的JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1 一抗4℃孵育过夜;次日,洗膜3 遍后室温孵育二抗1h,再次洗膜3 遍,采用BCA 试剂盒检测蛋白。在凝胶成像系统中显影得到蛋白条带,用Image J 图像处理软件对条带进行灰度值分析,根据灰度值计算蛋白相对表达量。
1.4 统计学方法
数据分析采用SPSS 18.0 统计软件,计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较用方差分析,进一步两两比较用SNK-q法,P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组小鼠24 h尿蛋白及Scr、BUN水平
各组小鼠24 h 尿蛋白及Scr、BUN 比较,经方差分析,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组较对照组高(P<0.05),TPL 组较模型组低(P<0.05),JAK1 组较模型组高(P<0.05),TPL+JAK1组较TPL 组高(P<0.05)。见表1。
2.2 各组小鼠肾脏病理变化
对照组小鼠肾脏大致正常,未出现明显的病理变化;模型组肾小球毛细血管损伤,炎症细胞浸润明显;TPL 组肾小球毛细血管损伤及炎症细胞浸润均较模型组减轻,JAK1 组肾小球毛细血管损伤及炎症细胞浸润均较模型组加重;TPL+JAK1 组肾小球毛细血管损伤及炎症细胞浸润均较TPL 组减轻。见图1。
表1 各组小鼠24 h尿蛋白及Scr、BUN水平比较 (n=8,±s)
表1 各组小鼠24 h尿蛋白及Scr、BUN水平比较 (n=8,±s)
注:①与对照组比较,P<0.05;②与模型组比较,P<0.05;③与TPL组比较,P<0.05。
组别24 h尿蛋白/mg Scr/(μmol/L)BUN/(mmol/L)对照组模型组TPL组JAK1组TPL+JAK1组F值P值5.84±0.94 23.32±5.58①10.32±2.52②28.93±6.72②19.29±3.48③37.142 0.000 32.12±6.68 79.49±13.48①45.68±10.23②94.51±14.27②74.51±12.84③37.037 0.000 10.38±2.35 35.75±8.49①17.68±4.51②42.49±9.24②33.24±8.68③27.619 0.000
图1 各组小鼠肾脏病理变化 (HE染色×200)
2.3 各组小鼠肾脏IgG及C3的免疫荧光强度比较
各组小鼠肾脏IgG 及C3 免疫荧光强度比较,经方差分析,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组较对照组高(P<0.05),TPL 组较模型组低(P<0.05),JAK1 组较模型组高(P<0.05),TPL+JAK1组较TPL 组高(P<0.05)。见表2 和图2、3。
2.4 各组小鼠血清及肾脏中IP-10、HMGB1 的质量分数
各组小鼠血清及肾脏中IP-10、HMGB1 的质量分数比较,经方差分析,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组较对照组高(P<0.05),TPL 组较模型组低(P<0.05),JAK1 组较模型组高(P<0.05),TPL+JAK1 组较TPL 组高(P<0.05)。见表3。
2.5 各组小鼠肾脏中JAK1、STAT1蛋白相对表达量
各组小鼠肾脏中p-JAK1、p-STAT1 蛋白相对表达量比较,经方差分析,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组较对照组高(P<0.05),TPL 组较模型组低(P<0.05),JAK1 组较模型组高(P<0.05),TPL+JAK1 组较TPL 组高(P<0.05)。见表4和图4。
表2 各组小鼠肾脏IgG和C3的荧光强度比较 (n=8,±s)
表2 各组小鼠肾脏IgG和C3的荧光强度比较 (n=8,±s)
注:①与对照组比较,P<0.05;②与模型组比较,P<0.05;③与TPL组比较,P<0.05。
组别C3 IgG对照组模型组TPL组JAK1组TPL+JAK1组F 值P 值0.89±0.18 6.29±1.07①1.88±0.35②8.04±1.22②5.77±0.86③105.498 0.000 1.02±0.24 6.68±0.94①2.21±0.45②8.20±1.32②5.96±1.02③95.341 0.000
图2 各组小鼠肾脏IgG的荧光强度 (免疫荧光染色×400)
图3 各组小鼠肾脏C3的荧光强度 (免疫荧光染色×400)
表3 各组小鼠血清及肾脏中IP-10、HMGB1的质量分数比较 (n=8,pg/mg,±s)
表3 各组小鼠血清及肾脏中IP-10、HMGB1的质量分数比较 (n=8,pg/mg,±s)
注:①与对照组比较,P<0.05;②与模型组比较,P<0.05;③与TPL组比较,P<0.05。
血清肾脏组别对照组HMGB1 2.77±0.52 IP-10 8.39±1.32 HMGB1 20.38±5.58 IP-10 1.84±0.35模型组TPL组JAK1组TPL+JAK1组F 值P 值8.21±1.32①4.02±0.77②11.28±1.94②8.33±1.42③57.591 0.000 26.58±4.52①13.47±2.44②34.28±7.69②24.57±5.56③36.801 0.000 65.85±12.12①31.38±8.38②80.28±15.52②59.49±11.74③39.418 0.000 5.58±0.89①3.02±0.65②7.35±1.24②5.34±0.81③54.325 0.000
表4 各组小鼠肾脏中p-JAK1、p-STAT1蛋白相对表达量比较 (n=8,±s)
表4 各组小鼠肾脏中p-JAK1、p-STAT1蛋白相对表达量比较 (n=8,±s)
注:①与对照组比较,P<0.05;②与模型组比较,P<0.05;③与TPL组比较,P<0.05。
组别p-JAK1 p-STAT1对照组模型组TPL组JAK1组TPL+JAK1组F 值P 值0.45±0.08 0.78±0.14①0.54±0.10②1.08±0.16②0.84±0.17③27.766 0.000 0.67±0.11 0.83±0.16①0.54±0.08②1.14±0.22②0.79±0.13③18.366 0.000
图4 各组小鼠肾脏JAK1、STAT1、p-JAK1、p-STAT1蛋白的表达
3 讨论
肾脏是SLE 常见的受累脏器,肾脏局部补体过度激活、炎症细胞因子异常分泌、免疫复合物沉积是引起肾脏损伤的主要病理因素[8-10]。在临床实践中,LN 是造成SLE 预后不良的危险因素,也是终末期肾脏病的常见病因,在SLE 的病情发展变化过程中对肾损伤进行积极防治具有积极的临床意义[11-13]。
目前,临床上治疗SLE 的主要药物包括糖皮质激素、羟氯喹、环磷酰胺等,起效迅速但毒副反应相对较多,并且缺乏治疗LN 的有效药物。雷公藤是具有清热解毒、祛风通络作用的中药,TPL是雷公藤中重要的活性成分,已被证实能够用于SLE、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的治疗[14-15],也有研究报道TPL 在肾小球肾炎治疗中的价值[16-17]。近些年,陆续有国内学者报道了TPL 在肾脏疾病治疗中的价值,秦登优等[5]和刘玉芳等[6]的研究分别以MRL/lpr 狼疮小鼠和Pristane 诱导的狼疮小鼠为研究对象,给予TPL 灌胃后观察到小鼠的肾损伤明显改善。本实验参照秦登优等[5]的研究,使用MRL/lpr 狼疮小鼠进行研究,并给予TPL 灌胃干预,通过生化指标及肾脏病理改变、免疫荧光染色结果发现24 h 尿蛋白、Scr、BUN 减少,肾脏病理改变减轻,IgG 及C3 的荧光强度减弱,表明TPL 干预使MRL/lpr 狼疮小鼠的肾损伤减轻,表现为肾功能的改善、局部免疫复合物及补体沉积的减少,这与既往关于TPL 改善狼疮小鼠肾功能的报道一致[5-6],提示TPL 可能在LN 防治中具有积极作用。
虽然越来越多的研究证实TPL 在SLE、LN 治疗中的价值,但是其分子机制尚不十分清楚。肾小球系膜是LN 病理损伤主要累及的部位,施栋梁等[7]、陈砚凝等[18]及XU 等[19]以肾小球系膜细胞为研究对象进行了细胞实验,通过IFN-γ刺激的方式模拟SLE发病过程中肾损伤的病理特征,观察到细胞中JAK1/STAT1 通路过度激活、下游促炎细胞因子IP-10 及HMGB1 的表达增加,IP-10、HMGB1 能够在局部招募免疫细胞,引起免疫应答紊乱,促进免疫复合物沉积,进而造成肾损害的发生。由此推测,JAK1/STAT1通路激活后IP-10、HMGB1表达增加可能参与SLE发病过程中的肾损害。而在IFN-γ刺激的同时予以TPL 干预后,JAK1/STAT1 通路的激活及下游IP-10、HMGB1 的表达均受到抑制,由此提示TPL 对JAK1/STAT1 通路的激活具有抑制作用,这也可能是TPL发挥治疗作用的分子机制。
LN 相关的动物实验表明,LN 动物肾脏中JAK1/STAT1 通路活化[20-22],抑制该通路能够减轻LN 的肾损害[23]。本实验在阐明TPL对狼疮小鼠肾功能的改善作用后,进一步分析了JAK1/STAT1 通路在TPL 改善肾功能中的作用。狼疮小鼠血清、肾脏中IP-10、HMGB1 的质量分数及肾脏中p-JAK1、p-STAT1 的表达水平均明显升高,表明狼疮小鼠肾组织JAK1/STAT1通路过度激活,与IFN-γ刺激后肾小球系膜细胞中JAK1/STAT1 通路过度激活的趋势一致;采用TPL 对狼疮小鼠进行干预后,血清、肾脏中IP-10、HMGB1 的质量分数及肾脏中p-JAK1、p-STAT1 蛋白相对表达量均明显降低,表明TPL 能够抑制狼疮小鼠肾脏中JAK1/STAT1 通路的激活,这可能是TPL 减轻肾损伤的分子机制。为了进一步验证这一机制,本实验设计了过表达JAK1 的腺病毒,尾静脉注射腺病毒后进行TPL干预,结果发现TPL减轻肾损伤、减少免疫复合物及补体沉积、降低IP-10 及HMGB1 的作用明显被削弱,由此证实抑制JAK1/STAT1 通路是TPL 减轻狼疮小鼠肾损伤的分子机制,TPL 能够通过抑制JAK1/STAT1减轻狼疮小鼠肾脏的病理改变。
综上所述,TPL 减轻MRL/lpr 狼疮小鼠肾损伤的分子机制可能是抑制JAK1/STAT1 通路介导的炎症反应,未来TPL 有望成为治疗SLE、预防LN 的候选药物。