建兰大青花朵脂肪酸类物质萃取条件优化及成分分析

郑燕，刘舒雅，曹映辉，童妍，赵凯，彭东辉，周育真

(1.福建农林大学园林学院，福建 福州 350002；2.兰科植物保护与利用国家林业与草原局重点试验室，福建 福州 350002；3.福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350117)

建兰(Cymbidiumensifolium)为兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)多年生草本植物，以其花姿优美、叶艺独特、香气馥郁等特点广受国人喜爱[1].香气是评价兰花品质的重要标准之一，不仅能提高兰花的审美价值和经济价值，而且在兰花授粉和植物防御方面起着重要作用[2].已有研究表明，建兰的特征性香气成分茉莉酸甲酯是以亚麻酸或亚油酸等脂肪酸类物质为香气前体代谢产生的[3-6].香气前体的浓度很大程度上决定挥发物的浓度，因此需要了解建兰脂肪酸类花香气前体物质成分及含量，才能更好的调节建兰花香的释放[7].

花香前体物质萃取常用的方法为溶剂萃取法，采用“相似相溶”的原理，用低沸点的有机溶剂加热提取植物材料[8].脂肪酸类物质只有在萃取效率高的情况下才能被更精确地检测出[9-10].因此，可以对萃取过程中的主要影响因素进行条件优化，以达到更佳的萃取效果，然而关于建兰花朵内脂肪酸类物质萃取条件优化的研究还未见报道.

建兰大青(C.ensifoliumDaQing)为浓香型品种，课题组前期研究发现茉莉酸甲酯为建兰大青主要花香物质成分(未发表).本研究以建兰大青为材料，通过有机溶剂萃取法萃取其花朵脂肪酸类前体物质后采用GC-MS联用仪检测其含量.采用单因素试验和正交试验对建兰脂肪酸类物质的料液比、萃取温度和萃取时间等萃取条件进行分析，旨在优化并建立有效的萃取方法与分析流程，为建兰大青花朵脂肪酸类物质萃取提供一定的理论和实践参考.

1 材料与方法

1.1 材料

本试验材料采自福建农林大学(N 26°04′51.3″，E 119°14′19.9″)森林兰苑大棚中收集的建兰大青.选择生长良好、长势一致的植株，于晴天中午11点～12点采集其盛开期花朵，用液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱.

1.2 方法

1.2.1 成分萃取 采用改良后的Paul溶剂萃取法[11]萃取建兰花朵脂肪酸类物质.将1朵建兰大青盛花花朵过液氮磨成粉末，收集于10 mL离心管中，加入一定量的正己烷后迅速涡旋混匀.在不同萃取温度和萃取时间条件下，经过200 W超声波清洗仪(型号200KDB，昆山公司)萃取后，8 000 r/min离心3 min.收集上清液至10 mL容量瓶中，加入0.5 mL的2 mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，静置甲酯化1 h，加入饱和氯化钠溶液至刻度线以上，瓶口磨砂位置以下约1 cm，待溶液分层后，取上清液过无水硫酸钠以除去水分(静置出现结晶为止).过滤膜装入进样瓶，将纯度98%的癸酸乙酯稀释500倍，取1 μL癸酸乙酯加入1.5 mL样品中，封口膜封口.每个处理3个生物学重复，保存于-20 ℃冰箱.

1.2.2 成分检测 使用岛津GC-MS-TQ8040仪器，气相色谱条件：色谱柱使用InertCap Pure-WAX气相色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为高纯氦气，不分流，总流量30 mL；程序升温：初始温度40 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率上升到180 ℃，以5 ℃/min的速率升到250 ℃，保持2 min.质谱条件为：CC-MS的接口温度250 ℃，电子轰击源EI；离子源温度260 ℃；电子能量70 eV；扫描质量范围50～600 aum；检测器电压为0.3 kV，溶剂延迟时间7 min.

1.2.3 试验设计 参考叶征美等[8]方法，在料液比为1∶3，萃取温度为40 ℃、萃取时间为30 min的基础条件下，保持其他因素不变，只改变其中一个因素，设置料液比分别为1∶1、1∶3、1∶5，萃取温度为20、40、60 ℃、萃取时间为10、30、50 min，以亚麻酸甲酯、亚油酸甲酯和茉莉酸甲酯3类脂肪酸类物质的相对含量总和为指标，每组试验重复3次进行单因素试验.得到单因素试验结果后进行L9(34)正交试验.

1.3 数据分析

1.3.1 物质定性与定量分析 通过G1701BA化学工作站数据处理系统，NIST98谱图库检索法结合人工谱图分析法进行定性分析.使用侯佳等[1]的内标法进行定量分析，在待测样品中加入内标物后根据内标物峰面积与待测样品组分峰面积的比值，计算待测样品中化学组分相对于内标的含量.各组分含量计算公式如下：

1.3.2 单因素试验与正交试验数据分析 所有试验数据利用SPSS 20.0统计分析软件，进行单因素方差分析(ANOVA)和正交试验的方差分析.利用Excel统计正交试验的极差分析.

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

通过单因素试验探讨不同料液比、不同萃取温度和不同萃取时间对脂肪酸类物质萃取量的影响(图1).结果表明：在其他条件相同的条件下，单一因素的料液比、萃取温度和萃取时间随着水平增加，脂肪酸类物质相对含量均呈现先增后降的趋势.当料液比为1∶3时，脂肪酸类物质萃取量达到最大值；随着萃取温度的升高，脂肪酸类物质在40 ℃时萃取量达到最大值；当超声时间达到30 min时，脂肪酸类物质萃取量最高.因此，只考虑单因素变化时，料液比为1∶3较佳，萃取温度40 ℃较佳，萃取时间30 min较佳.

图1 单因素试验结果Figure 1 Results of single factor experiment

2.2 正交试验结果

由于料液比(A)、萃取温度(B)、萃取时间(C)3个因素间能相互影响，因此在上述单因素试验的基础上，采用L9(34)正交试验，以获取最佳组合条件.R值反映了因素的水平变动时，试验指标的变动幅度.依据R值的大小，可以判断因素的主次.由表2可知：本试验中R值大小为RA>RB>RC，3个因素的主次关系是：A(料液比)>B(萃取温度)>C(萃取时间).k值的大小反映了因素对试验指标影响的大小.料液比的k1>k2>k3，可判断A1为料液比的优水平；同理判断萃取温度和萃取时间的优水平分别是B1和C1.因此，最优萃取组合条件为A1B1C1，即：料液比为1∶2，萃取温度为30 ℃，萃取时间为20 min.

通过进一步的方差分析发现(表3)，料液比(A)和萃取温度(B)对脂肪酸类物质萃取有显著影响(P<0.05)，而萃取时间(C)影响不显著(P>0.05).

2.3 建兰大青花朵内源物质成分及含量

有机溶剂萃取建兰大青内源物质的GC-MS总离子流图见图2.由图2可见，含量较高的内源物质主要在20 min后被检测到，本试验总共检测出46种化学物质.通过成分归类，主要物质成分为酯、烷、醇、萜类等(表3).脂肪酸类物质的相对含量最高，共13种，占累计检出化合物的93.07%，其中亚麻酸甲酯最高，占39.56%，其次为亚油酸甲酯(32.19%)、棕榈酸甲酯(13.10%)和反-9-十八碳烯酸甲酯(3.80%).同时还检测出一些非脂肪酸成分，含量较高的为烷烃类，共22种，占累计检出化合物的5.38%；其余醇类、萜烯类等共占累计检出化合物的1.59%.

表1 L9(34)正交试验设计及极差分析

表2 正交试验的方差分析

图2 建兰大青花朵内源物质的GC-MS总离子流图Figure 2 Total ion chromatograms of endogenous compounds from C.ensifolium Daqing flowers

表3 建兰大青花朵甲酯后内源物质成分含量

3 讨论

为探究建兰内源脂肪酸类香气前体的含量，本研究采用单因素结合正交试验方法优化了建兰大青花朵内源脂肪酸类物质的萃取条件，并利用气质联用技术对其花朵内源物质进行分析，确定料液比1∶2、萃取温度30 ℃、萃取时间20 min为最适条件组合.白三叶草籽[12]、杜仲籽[13]和沙棘果等提取[14]脂肪酸试验与本试验结果相似，提取过程中增加萃取溶剂，溶剂与样品接触面积越大，萃取效率越好.但植物材料不同，最适液料比差别较大，白三叶草籽和杜仲籽液料比大约为1∶10，而沙棘果油的提取液料比为1∶70.与黄芪籽[15]和千层金等[8]精油提取的结果类似，过高温度会造成萃取溶剂的挥发，导致萃取物质得率下降.本试验中溶剂正己烷的沸点较低，推测是由于温度持续升高正己烷损失导致最后含量减少.因此，液料比、萃取温度和时长设置需考虑到所萃取物质以及萃取溶剂的沸点和稳定性.

从建兰大青花朵中总共检测出46种内源物质，脂肪酸类物质和烷烃类物质含量最高，其中亚麻酸甲酯的相对含量最高，达到39.56%.刘运权等[1]在建兰原生种、铁骨素、金丝凤尾素的挥发性成分中发现脂肪酸类衍生物的相对含量较高；建兰品种小桃红的挥发物各类成分主要为酯类、烷类和萜烯类等[2].这些建兰品种的挥发性花香物质的成分与建兰大青花朵内源物质的分类大致相同.本研究结果与墨兰精油的研究结果相似，墨兰精油主要物质成分也为脂肪酸类，但脂肪酸的种类不同.采用同时蒸馏萃取法萃取的墨兰品种小香和企黑的花蕾精油，结果表明其主要组分为棕榈酸[16-17].而苯环类4-甲基苯酚和β-紫罗兰酮在盛花期的含量增加最多.墨兰的主要挥发性花香物质成分为甲基-异丁子香酚和6-氧代庚酸甲酯等[18].因此建兰与墨兰的挥发性物质成分不同，可能是由于花香内源前体物质具有差异，这需要后续进一步验证.

本研究采用不同的前期处理方法，对建兰大青脂肪酸类物质进行萃取和鉴定，得到的最适条件可用于后续对建兰不同时期、不同品种花朵内源物质的检测，有助于探究建兰花香的产生、汇集储存和释放规律，为建兰香气形成机理及其香花品种的产生和利用提供一定的理论参考.

4 结论

1) 建兰大青脂肪酸类物质萃取最佳条件为：料液比1∶2，萃取温度30 ℃，萃取时间20 min，提取质量分数为97.87 μg/g.

2) 建兰大青花朵的物质成分中脂肪酸类物质占累计检出化合物的93.07%，其中亚麻酸甲酯相对含量最高，为39.56%；其次为烷烃类，占累计检出化合物的5.38%.