MS-222和丁香酚对亚东鲑鱼麻醉效果的比较

2021-02-24王金林王万良张忭忭谭大明

甘肃农业大学学报 2021年6期

王金林，王万良,张忭忭,2，谭大明

(1.西藏自治区农牧科学院水产科学研究所，西藏拉萨 850000；2.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海杨浦区 200000；3.西藏自治区农牧科学院农业资源与环境研究所，西藏拉萨 850000)

亚东鲑(Salmontrutta)，俗称花点鱼，隶属于鲑形目、鲑科、鲑属，由英国人于19世纪引进西藏亚东县，距今约有150多年历史，现已成为一个地方性养殖品种，国内仅分布于西藏日喀则市亚东县亚东河[1-4].该鱼因肉质细嫩、营养丰富而深受消费者喜爱，2014年被农业部批准为国家农产品地理标志产品[5].近些年，由于人类过度干拢，造成部分河流生境片段化和破碎化[6]，导致西藏土著鱼类自然资源量急剧减少.亚东鲑于1992年被列为西藏二级重点水生野生保护动物.近年当地相关部门开展了人工增殖放流工作，对亚东鲑种质资源保护与种群维系起到了一定作用[7].目前有关亚东鲑的研究报道主要集中在繁殖生物学[8]、分子生物学[9-12]、养殖生物学[13-15]、生理生化及饲料营养[16-17]等方面.但由于亚东鲑引种时间较长，种质资源退化现象十分严重，为了在资源调查及人工大规模选育操作过程中降低死亡率，开展麻醉试验对其资源保护与产业化发展具有十分重要的意义.

在水产养殖领域使用麻醉剂的主要目的是保持麻醉对象相对安静，减少应激损伤.其作用机理是通过抑制鱼的中枢和周围神经系统冲动，使麻醉对象暂时失去知觉，当麻醉药物通过新陈代谢排除后又可复苏，并能恢复正常生理活动[18].MS-222和丁香酚是水产养殖中常用的鱼用麻醉剂，目前已成功应用于中华鲟(Acipensersinensis)、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)等鱼类[19].MS-222俗称鱼安定，化学名称为间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，白色粉末状，易溶于水，具有见效快、复苏时间短、安全性高、对处理过的水产动物及人体接触无害等特点，在全世界被广泛应用；丁香酚是一种植物香料，其分子式为C10H12O2，淡黄色微稠液体，具有强烈的丁香气味，可溶于乙醇等非极性溶剂，广泛存在于丁香油、樟脑油和肉桂叶油等芳香油中，其优点是成本较低、毒性小[20-21].本文通过MS-222和丁香酚对亚东鲑鱼种进行麻醉效果比较试验，分析了不同水温和空气暴露时间对亚东鲑鱼麻醉效果的影响，明确适宜的麻醉剂和安全使用浓度，以期为亚东鲑采样、人工生产选育和增殖放流标记等提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2020年10月在西藏雅鲁藏布江鱼类资源繁育基地实验室进行，选择体色正常、体表完整、体格健壮、活力强的人工繁育鱼种，平均体质量为(143.2±7.44)g.试验水源为地下水，经沉淀、曝气、紫外杀菌后流入圆形玻璃缸中(直径1 m，水深0.5 m)暂养，溶解氧质量浓度7.5 mg/L，pH 7.6，水温(12±0.5)℃，试验开始前48 h禁止投喂.

1.2 试验装置及药品

试验容器为0.4 m×0.2 m×0.5 m亚克力材质鱼缸，连续曝气供氧，保持溶解氧质量浓度≥7 mg/L.MS-222(杭州动物药品厂)：白色粉末，易溶于水，使用时直接称量(精确至0.000 1g).丁香酚(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)：相对分子量为164.2，纯度≥99%，淡黄色液体.参照郝长杰等[22]方法，使用时与乙醇按体积比1∶5溶于乙醇后再溶于水.

1.3 麻醉和复苏过程分期及预试验设置

参照刘长林等[23]划分标准，结合预试验结果对亚东鲑麻醉和复苏过程进行分期.麻醉阶段分为A0～A6共7个阶段，包括正常期(未使用麻醉剂鱼体状态)，复苏阶段划分为R1～R4共4个阶段，具体划分标准见表1.当鱼体失去平衡，腹面朝上，相对静止不动，鳃盖张合降低但连续，即判断为麻醉期(A4)；当鱼体能够正常游泳，恢复对外界刺激反应，将鱼体侧置后缓缓恢复平衡，即判断为鱼已复苏(R3).

表1 亚东鲑麻醉和复苏过程分期及主要行为特征

1.4 MS-222和丁香酚对亚东鲑鱼种麻醉及复苏时间的确定

根据预试验对亚东鲑麻醉及复苏进行分析，参考麻醉药物使用剂量，设置MS-222浓度梯度为100、110、120、130、140、150、160 mg/L 7个梯度组，丁香酚浓度梯度为50、60、70、80、90、100、110 mg/L 7个梯度组.试验开始前将鱼放在容器中适应10 min，每组放鱼30尾，各设3个平行，每个平行10尾.放入麻醉剂后迅速搅拌水体，仔细观察鱼体麻醉状态，一旦达到A6期，及时捞出，并迅速放入提前曝气增氧的备用容器中自然复苏，准确记录麻醉和复苏时间，并统计24 h成活率.试验期间水温(12±0.5)℃.

1.5 不同水温条件下MS-222和丁香酚对亚东鲑鱼种的麻醉效果

根据1.3和1.4的试验结果，设置水温(8±0.5)、(10±0.5)、(12±0.5)、(14±0.5)、(16±0.5) ℃.将鱼放入容器后，低温采用冰块降温，每小时降低1 ℃，高温采用加热棒调控，每小时升温1 ℃，达到温度标准后适应0.5 h后开始试验.参考李伟业等[23]确定最适麻醉药物效果剂量，选择130 mg/L MS-222和60 mg/L丁香酚进行麻醉效果试验，每组放鱼30尾，各设3个平行，每个平行10尾，准确记录麻醉(A6) 和复苏时间(R4)，并记录24 h成活率.

1.6 不同空气暴露时间MS-222和丁香酚对亚东鲑鱼种的麻醉效果

根据1.3和1.4的试验结果，选择130 mg/L MS-222和60 mg/L丁香酚进行麻醉效果试验.设置空气暴露时间为0、5、10、15、20、25 min，每组放鱼30尾，各设3个平行，每个平行10尾，水温12 ℃，麻醉至A6后快速捞出，用湿润的毛巾包裹，仅头部暴露在空气中，准确记录复苏时间和24 h成活率.

1.7 数据处理

所有数据采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，用Duncan法进行显著性分析和多重比较，并用Excel 2010软件作图.

2 结果与分析

2.1 亚东鲑预试验麻醉效果

MS-222为10、25、40 mg/L时，麻醉最终状态分别达到轻度镇定期(A1)、深度镇定期(A2)、麻醉期(A4)；MS-222为55～85 mg/L时，麻醉最终状态均能达到延髓麻醉期(A6)，且麻醉时间呈递减趋势，复苏时间呈递增趋势，24 h成活率为100%.丁香酚为5、10 mg/L时，麻醉最终状态分别达到轻度麻醉期(A3)、麻醉期(A4)；丁香酚为15～40 mg/L时，麻醉最终状态均能达到延髓麻醉期(A6)，且麻醉时间呈递减趋势，复苏时间呈递增趋势，24 h成活率为100%(表2).

表2 MS-222和丁香酚预试验麻醉效果分期统计表

2.2 MS-222和丁香酚对亚东鲑鱼种麻醉效果的有效浓度

MS-222对亚东鲑的有效麻醉浓度如图1所示.在水温(12±0.5)℃条件下，随着MS-222质量浓度升高，亚东鲑鱼种麻醉时间逐渐缩短，100 mg/L的麻醉时间较长，且各质量浓度之间差异显著(P<0.05)，麻醉时间与质量浓度最佳拟合关系式为：y=-0.65x2- 44.99x+360.87，R2=0.988 7；复苏时间随着质量浓度升高逐渐递增，100 mg/L复苏时间最短，与110、120 mg/L之间差异不显著(P>0.05)，但显著低于其他各组(P<0.05)，140、150、160 mg/L之间差异显著(P<0.05)，24 h复苏率均为100%，复苏时间与质量浓度最佳拟合关系式为：y=11.69x2-36.80x+179.79，R2=0.982 7.

丁香酚对亚东鲑有效麻醉浓度如图2所示.在水温(12±0.5) ℃条件下，随着丁香酚质量浓度升高，亚东鲑鱼种麻醉时间逐渐缩短，50 mg/L麻醉时间较长，且各质量浓度之间差异显著(P<0.05)，麻醉时间与质量浓度最佳拟合关系式为：y=0.97x2-30.32x+213.27，R2= 0.989 4；复苏时间随着质量浓度升高依次递增，110 mg/L复苏时间较长，各组之间差异显著(P<0.05)，24 h复苏率均为100%，复苏时间与质量浓度最佳拟合关系式为：y=-2.58x2+90.07x+381.13，R2=0.980 3.

图1 不同浓度MS-222对亚东鲑(Salmon trutta)麻醉时间和复苏时间的影响Figure 1 Effects of different concentrations of MS-222 on anesthesia time and resuscitation time of S.trutta

2.3 不同水温对MS-222和丁香酚麻醉效果的影响

不同水温对MS-222麻醉效果的影响如图3所示.随着水温的升高，麻醉时间依次递减，8 ℃麻醉时间较长，16 ℃麻醉时间相对较短，各组之间差异显著(P<0.05)；复苏时间随着水温的升高依次递减，8 ℃复苏时间较长，16 ℃复苏时间相对较短，各组之间差异显著(P<0.05).

不同水温对丁香酚麻醉效果的影响如图4所示.随着水温的升高，麻醉时间依次递减，8 ℃麻醉时间较长，16 ℃麻醉时间相对较短，各组之间差异显著(P<0.05)；复苏时间随着水温的升高依次递减，8、10 ℃复苏时间差异不显著(P>0.05)，但显著高于其他各组(P<0.05)，12、14、16 ℃各组之间差异显著(P<0.05).

图2 不同浓度丁香酚对亚东鲑(Salmon trutta)麻醉时间和复苏时间的影响Figure 2 Effects of different concentrations of clove oil on anesthesia time and resuscitation time of S.trutta

图3 不同水温条件下MS-222对亚东鲑(Salmon trutta)麻醉效果的影响Figure 3 Effect of MS-222 on anesthetic efficacy of Salmon trutta at different water temperature

图4 不同水温条件下丁香酚对亚东鲑(Salmon trutta)麻醉效果的影响Figure 4 Effect of clove oil on anesthetic efficacy of Salmon trutta at different water temperature

2.4 空气暴露时间对MS-222和丁香酚麻醉效果的影响

随着空气暴露时间增加，MS-222对亚东鲑鱼种麻醉后复苏时间依次递增，各组之间差异显著(P<0.05)，在0～20 min内，复苏成活率为100%；当空气暴露时间达到25 min时，成活率仅为66.7%(图5).随着空气暴露时间增加，丁香酚对亚东鲑鱼种麻醉后复苏时间呈先降低后递增变化趋势，且各组之间差异显著(P<0.05)，在0～15 min内，复苏成活率为100%；当空气暴露时间达到20、25 min时，成活率分别下降至60.0%、20%(图6).

图5 不同空气暴露时间条件下MS-222对亚东鲑(Salmon trutta)麻醉效果的影响Figure 5 Effects of MS-222 on anesthetic efficacy of Salmon trutta at different air exposure time

图6 不同空气暴露时间条件下丁香酚对亚东鲑(Salmon trutta)麻醉效果的影响Figure 6 Effects of clove oil on anesthetic efficacy of Salmon trutta at different air exposure time

3 讨论

3.1 MS-222和丁香酚对亚东鲑的麻醉效果

目前常用的鱼用麻醉剂有30多种，包括MS-222、丁香酚、2-苯氧乙醇和硫酸喹哪啶等[23].在渔业生产和科学实验研究过程中，可以根据不同目的进行不同程度麻醉脑部感觉中枢系统，使鱼类降低新陈代谢或失去反射动作，从而减少应激活动和呼吸代谢，以此提升其成活率[25-26].通常鱼类种类、个体大小及水质差异均对麻醉效果产生一定影响.

一般处于深度镇静期状态下的鱼体对外界反应能力很弱，有利于生产运输.本试验结果发现，MS-222质量浓度在0～25 mg/L时，亚东鲑鱼体处于深度镇定期范围内；而丁香酚质量浓度在5 mg/L时，亚东鲑鱼体进入轻度麻醉期；可见与MS-222相比，亚东鲑对丁香酚极为敏感，这与王文豪等[27]在大口黑鲈幼鱼模拟运输试验中的麻醉效果相似.另外，MS-222和丁香酚均能在短时间内使亚东鲑快速进入麻醉状态，抑制其活动能力，降低应激反应；且随着MS-222和丁香酚浓度增加，亚东鲑鱼种麻醉时间缩短，复苏时间延长，表明相同条件下麻醉剂剂量越大，鱼体麻醉程度越深，入麻时间越短，复苏时间越长，这与大多数学者研究结果一致[24].

有学者认为，鱼类最适麻醉质量浓度为3 min内完全麻醉，5 min内恢复自然状态[24].按照此标准，郝长杰等[22]麻醉试验结果表明，MS-222质量浓度为120～140 mg/L、丁香酚质量浓度为60～70 mg/L时，对暗纹东方鲀(Takifuguobscurus) 幼鱼具有最适的麻醉效果；而王文豪等[27]报道MS-222和丁香酚对大口黑鲈(Micropterussalmoides) 幼鱼的理想麻醉质量浓度分别为70、16 mg/L.本试验结果显示，MS-222对亚东鲑鱼种的最适麻醉质量浓度为130～140 mg/L，而丁香酚在60～110 mg/L范围内均能在180 s内麻醉，但复苏时间均超过300 s，无法达到最适麻醉状态，这表明鱼的种类差异导致麻醉效果不同，大口黑鲈对MS-222和丁香酚极为敏感，所以其麻醉的质量浓度远低于亚东鲑和暗纹东方鲀；另外，用丁香酚麻醉亚东鲑后复苏时间比暗纹东方鲀要长很多，可能是由于暗纹东方鲀长期在海水中生存造成生活习性不同所致，但具体原因有待进一步研究.因此，建议应根据不同鱼类选用适宜的麻醉剂，并建立相应的鱼类麻醉剂使用标准，引导麻醉剂的安全使用和管理，促进水产养殖产业健康发展和渔业资源的有效保护.

3.2 水温对MS-222和丁香酚麻醉效果的影响

鱼类属于变温动物，一般情况下随着水温升高，鱼体新陈代谢增强，呼吸频率加快，耗氧量增加，机体酶活性升高[28].有研究结果表明，随着水温下降，鱼体入麻时间缩短，麻醉效果随水温的降低而增加，低温本身对鱼体具有麻醉作用[29-30].本试验结果显示，随着水温降低，MS-222和丁香酚的麻醉时间和复苏时间延长，与上述报道结果不一致，主要原因是亚东鲑属于冷水性鱼类，最适生存水温为13～18 ℃，在一定范围内水温越低，亚东鲑新陈代谢降低，单位时间内机体摄入麻醉剂剂量减少，从而导致相同浓度MS-222和丁香酚对其麻醉时间延长；另外，通过观察，高水温中复苏后的亚东鲑鱼种活动力比低水温中的强，可能原因是随着水温上升，亚东鲑机体酶活性增强，显著提升了肝脏降解麻醉剂能力，从而复苏时间相应缩短.因此，水温对鱼体麻醉及复苏效果不仅与麻醉剂种类有关，且与鱼的生活习性及最适生存水温有关，其作用机制还有待进一步深入研究.

3.3 空气暴露时间对深度麻醉亚东鲑鱼种复苏时间的影响

已有研究报道，适宜质量浓度麻醉剂延髓麻醉鱼体后，在空气中暴露一段时间，不会造成鱼类死亡，仍能保持较高的成活率[31]，这对鱼体离水操作具有十分重要的意义.刘艳超等[32]、王万良等[33]开展了在空气暴露不同时间，MS-222和丁香酚对异齿裂腹鱼(Schizothoraxoconnori) 麻醉效果试验，结果显示在空气中暴露0～15 min，大规格异齿裂腹鱼复苏时间各组之间差异不显著，而小规格各组之间差异显著；采用丁香酚深度麻醉后，随着空气中暴露时间延长，复苏时间呈现递增趋势，且在0～35 min内成活率仍能保持100%.

本试验结果表明，经MS-222脊髓麻醉期后，随着空气暴露时间延长，亚东鲑鱼种复苏时间递增，且在0～20 min成活率为100%，各组之间差异显著，到25 min后成活率降低，这与上述小规格异齿裂腹鱼的试验结果相似；而经丁香酚进行延髓麻醉期后，随着空气暴露时间延长，亚东鲑复苏时间呈先降低后递增变化趋势，各组之间差异显著，且在0～15 min复苏成活率为100%；当空气暴露时间达到20、25 min时，成活率分别为60.0%和20%，与上述试验结果差异较大，其主要原因可能是二者体皮肤系统代谢功能存在差异，加之麻醉剂效果分期不同，从而导致亚东鲑空气暴露后复苏时间缩短.由此可知，在资源调查、离水采样及增殖放流标记时，MS-222比丁香酚具有更好的麻醉效果.