基于STAT-3/NF-κB/ICAM-1通路探讨丹皮酚缓解小鼠结肠炎相关性结直肠癌的作用机制

刘 博，张传凤，马克龙，汪长中，颜贵明

(安徽中医药大学，安徽 合肥 230012)

炎症性肠病是一类肠道的慢性炎症性病变，主要包括溃病性结肠炎和克罗恩病。在炎症—不典型增生—肿瘤的演变过程中牵涉众多因子的异常表达和释放。核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)是一种炎症因子启动子，也被称为“免疫应答的中心调节剂”。在肿瘤中，激活的信号转导及转录激活因子3(signal transducers and activators of transduction-3，STAT-3)通过抑制NF-κB的核输出来维持NF-κB的活性。有关研究证实了STAT3和NF-κB在肿瘤中的协同作用。活化的STAT3可以促进一些促癌基因的表达，NF-κB信号通路被激活，诱导其下游炎症因子或细胞因子的转录和表达，细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)作为一种炎症递质，可反映机体是否存在异常免疫状态，其可使炎症部位产生粘连，增强炎症细胞与内皮细胞的黏附，促进内皮细胞的活化，使其更容易穿透内皮细胞。

丹皮酚能抑制多种肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，还可增加肿瘤细胞对放化疗的敏感性。研究表明，由脂多糖诱导的肺炎损伤的小鼠模型给予一定的丹皮酚治疗，能使白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)、IL-6等细胞因子的含量明显降低，说明丹皮酚对炎症有一定的抑制作用。然而，丹皮酚是否能够减轻肠道的炎症反应，抑制炎症向肿瘤的恶化，目前尚不清楚。本研究通过丹皮酚干预氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)/葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate，DSS)诱导的小鼠结肠炎相关结肠癌，探讨丹皮酚在其过程中的作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF级健康雄性C57BL/6小鼠，6～8周龄，体质量为(23±2)g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司[生产许可证号：SCXK(鲁)2014—0007]。小鼠适应性喂养1周。

1.2 药物与试剂 美沙拉嗪(国药准字 H20143164)：上海爱的发制药有限公司；DSS(批号 S0948)：美国MP Biomedicals公司；丹皮酚(批号 ZL150806)：南京泽郎生物科技有限公司；STAT-3(批号 AF6294)、NF-κB p65(批号 AF5006)、ICAM-1抗体(批号 AF6088)、一抗稀释液(批号 P0023A)：碧云天生物技术公司；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6、IL-1β和IL-10 ELISA试剂盒(批号 06/2019)：上海酶联生物科技有限公司。

1.3 仪器 YD-6L生物组织冷冻包埋机、YD-315轮转式切片机、YD-AB摊烤片机：金华市益迪医疗设备有限公司；H1-16KR型冷冻离心机：湖南可成仪器设备有限公司；K3型酶标仪：LabServ公司；OLYMPUSBX51正置显微镜：上海富莱光学公司。

2 方法

2.1 动物模型复制 雄性6～8周C57BL/6小鼠120只，适应性喂养1周，被随机分为空白组、模型组，空白组20只，模型组100只。其中空白组全程自由饮食；模型组小鼠按12.5 mg/kg腹腔注射AOM 1周，后饮用含3% DSS水溶液1周，接着饮用蒸馏水2周，全程共3个周期，每个周期分为1周致病期和2周恢复期。3% DSS致炎剂第二轮结束后，随机取3只小鼠，肉眼可见结肠有水肿、充血和增生症状，留取结肠，对其进行病理切片、染色，观察到结肠组织有腺体缩短、增生，肿瘤生成的状况，表明炎症模型复制成功。

2.2 分组与给药 将模型复制成功的小鼠随机分为5组：模型组，丹皮酚高剂量(480 mg/kg)、中剂量(240 mg/kg)、低剂量组(120 mg/kg)组，美沙拉嗪组(200 mg/kg)。灌胃容积：10 mL/kg。

2.3 标本处理 取标本前一晚小鼠禁食不禁水，次日上午麻醉、取眼球血。取血后开腹，摘取结肠，对肿瘤进行计数，将一部分结肠固定于10%甲醛中，用于病理检测，将另一部分保存于-80 ℃冰箱，用于Western blot检测。称脾脏质量，计算脾脏指数。

2.4 结肠的组织形态学观察 取甲醛固定的结肠，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切成4 μm薄片，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色。在200倍光学显微镜下观察结肠的组织形态学变化。

2.5 血清炎症因子检测 从小鼠眼球取血，室温静置1 h，4 ℃下4 000 r/min离心15 min，取上清液。根据ELISA试剂盒说明书检测TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10水平。

2.6 免疫组织化学法检测蛋白表达水平 取4 μm石蜡切片，常规脱蜡水化，灭活内源性过氧化物酶，微波修复抗原，PBS洗涤3次，滴加一抗STAT-3、NF-κB p65、ICAM-1，4 ℃孵育过夜，隔天用PBS缓冲液冲洗3次后，滴加通用型二抗适量，37 ℃孵育30 min，DAB显色，复染，脱水，封片。显微镜观察蛋白的表达情况。

2.7 Western blot法检测蛋白表达水平 取结肠组织，根据组织蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白样品。SDS-PAGE制胶电泳，切胶，转膜，脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗涤3次。加一抗STAT-3(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、ICAM-1(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次，二抗(羊抗兔，1∶10 000)室温孵育2 h，TBST洗涤3次。配制显影液，曝光显影。

3 结果

3.1 各组小鼠结肠肿瘤生长情况比较 肉眼观察可见：空白组小鼠结肠光滑平整，模型组结肠组织上肿瘤生长密集，数量较多，肿瘤间距小；与模型组比较，各治疗组用药后结肠中肿瘤数量、间距、大小均有一定改善，尤其是丹皮酚中剂量组结肠肿瘤间距明显增大，数量明显减少。

3.2 各组小鼠结肠肿瘤数量、肿瘤质量及脾脏指数比较 与空白组比较，模型组小鼠的脾脏指数明显升高(

P

<0.05)；与模型组比较，各治疗组小鼠的脾脏指数均显著降低(

P

<0.05)，肿瘤数量及肿瘤质量均显著下降(

P

<0.05)；丹皮酚降低肿瘤数量、肿瘤质量及脾脏指数的作用呈剂量依赖性(

P

<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠结肠肿瘤数量、肿瘤质量及脾脏指数比较

3.3 各组小鼠结肠组织病理学变化比较 与空白组比较，模型组结肠炎症浸润明显，有隐窝产生，杯状细胞减少，上皮组织不典型增生明显，有腺瘤样改变；美沙拉嗪组及丹皮酚高、中、低剂量组小鼠结肠黏膜病变均有不同程度的改善，丹皮酚组相较于美沙拉嗪组有较多的炎症细胞浸润和隐窝。见图1。

注：A.空白组；B.模型组；C.美沙拉嗪组；D.丹皮酚高剂量组；E.丹皮酚中剂量组；F.丹皮酚低剂量组

3.4 各组小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10水平比较 与空白组比较，模型组小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著升高(

P

<0.05)，IL-10水平显著降低(

P

<0.05)。与模型组比较，各治疗组小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著降低(

P

<0.05)，IL-10水平显著升高(

P

<0.05)。丹皮酚中剂量组降低血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平和升高IL-10水平的作用最优。见表2。

3.5 各组小鼠结肠组织中STAT-3、NF-κB p65、ICAM-1表达水平比较 免疫组织化学法检测结果显示，空白组结肠组织仅少量细胞胞质内可见棕黄色颗粒，模型组胞质、胞核均可见棕黄色和褐色颗粒。各治疗组与模型组相比，细胞核内棕黄色和褐色颗粒明显减少。见图2。

Western blot法检测结果显示，与空白组比较，模型组小鼠结肠组织中NF-κB p65、STAT-3、ICAM-1蛋白表达水平均显著升高(

P

<0.05)；与模型组比较，各治疗组小鼠结肠组织中NF-κB p65、STAT-3、ICAM-1表达水平显著降低(

P

<0.05)或呈降低趋势；丹皮酚中剂量组降低结肠组织中NF-κB p65、STAT-3、ICAM-1蛋白表达水平的作用最优(

P

<0.05)。见图3、表3。

表2 各组小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10水平比较

注：A.空白组；B.模型组；C.美沙拉嗪组；D.丹皮酚高剂量组；E.丹皮酚中剂量组；F.丹皮酚低剂量组

注：A.空白组；B.模型组；C.美沙拉嗪组；D.丹皮酚高剂量组；E.丹皮酚中剂量组；F.丹皮酚低剂量组

4 讨论

中国溃疡性结肠炎的发病率日益增多，近10年的发病率增加了近3倍。本研究按照Li等方法采用AOM/DSS诱导结肠癌模型：肉眼可见模型小鼠结肠长度缩短，结直肠表皮有肿瘤生成；显微镜下可见结肠组织有炎症细胞浸润，结构排布错乱，肠黏膜破损等现象。

丹皮酚是牡丹干燥根皮中一种有效成分，既往研究表明，其能够有效改善肠黏膜病变，缓解炎症反应，降低体内IL-1、TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平。本研究中，模型组小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β水平高于空白组，表明肠道局部和全身系统的炎症发生。给予丹皮酚治疗后，与模型组相比，血清IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低，表明丹皮酚对结肠炎有抑制作用。丹皮酚通过抑制肿瘤细胞增殖，调控其凋亡，发挥抗肿瘤作用。在本研究中，经丹皮酚治疗后，结肠黏膜的炎症细胞浸润、腺体紊乱等现象减轻，且肠表皮肿瘤数量减少，肿瘤质量减轻，说明丹皮酚对AOM/DSS方法诱导的小鼠“炎—癌转化”有较好的治疗作用。

表3 各组小鼠结肠组织STAT-3、NF-κBp65、ICAM-1蛋白表达水平比较

在肿瘤组织中，往往存在免疫功能被抑制的情况，而炎症却异常活跃，产生大量炎症因子，促进组织炎症反应，并增加肿瘤的发生率。IL-6是一种多功能细胞因子，IL-6诱导信号转导及其转录，活化STAT3，阻断IL-6与STAT3的关系，降低STAT3下游分子Bcl-xl的表达水平，进一步降低Bcl-xl调控细胞凋亡的能力，降低“炎—癌转化”的风险。炎症肠病促进异型增生的肠上皮细胞增殖并凋亡。本实验结果显示，模型组小鼠血清中促炎症因子IL-6含量显著增加，从蛋白水平验证了丹皮酚对致病小鼠的保护作用与STAT3表达信号转导调节有关。同时,美沙拉嗪作为阳性对照药也可能通过干预此信号转导对小鼠结肠起到保护作用，丹皮酚与美沙拉嗪对上述信号转导的调节保持一致，与上述文献报道呼应。IL-10是一种具有重要免疫调节功能的抗炎细胞因子，对TNF-α、IL-6和IL-1等其他炎症因子有抑制作用。本实验结果显示，模型组小鼠血清IL-10水平下降，TNF-α水平升高，与上述文献报道一致。NF-κB是一种炎症因子启动子，也即“免疫应答的中心调节剂”。NF-κB的活化可以诱导肠道中分泌一系列细胞因子以诱导STAT3活化，加速癌症发生，两者存在协同效应。NF-κB信号通路被激活，诱导一些炎症因子的激活，TNF-α表达水平升高，白细胞被激活，发生局部炎症反应，同时通过刺激ICAM-1的合成，造成中性粒细胞浸润，进一步加重神经细胞损伤。

本实验结果表明，丹皮酚通过STAT-3/NF-κB/ICAM-1信号通路干预小鼠结肠的“炎—癌转化”。下一步将从信号转导分子的基因表达水平探究丹皮酚干预结肠“炎—癌转化”的机制。