新藤黄酸通过PTEN-PI3K/AKT/VEGF/eNOS信号通路干预人脐静脉内皮细胞血管生成的研究

高 俊，程 卉，李庆林

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038)

细胞迁移也称为细胞爬行，是正常细胞的基本功能之一，表现为细胞头部伪足延伸、建立新的黏附、细胞体尾部收缩的交替进行，是机体正常生长发育的生理过程。细胞迁移涉及血管生成、癌症转移、炎症反应、动脉粥样硬化等过程。

肿瘤血管生成是从已存在的血管床中形成新生血管，是一个受众多生长因子调节的复杂的病理生理过程，多种细胞因子和细胞基质参与肿瘤的生长、转移、复发。其过程包括：肿瘤细胞与正常血管内皮细胞相互作用；肿瘤细胞与细胞外基质相互作用；相关细胞的参与及大量白细胞因子的调节，使得新生血管得以形成。抗肿瘤血管生成的主要机制：抑制促血管生成因子与配体的表达和结合及相应的信号传递途径，抑制血管内皮细胞的增殖、迁移，抑制基底膜的降解等。

藤黄是藤黄科植物藤黄的干燥树脂，具有攻毒蚀疮、破血散结等功效。现代研究表明，新藤黄酸(gambogenic acid，GNA)为藤黄中的活性成分之一，具有良好的抗肿瘤活性。本课题组前期研究发现，GNA对多种肿瘤细胞如人乳腺癌MCF-7和人肝癌BEL-7402细胞的增殖均有抑制作用。近期实验研究表明，GNA对肿瘤的血管生成、侵袭转移也具有一定的抑制作用。本研究选择人肺腺癌A549细胞和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial, HUVECs)建立体外非直接接触式共培养体系，观察GNA对HUVECs迁移能力的影响，探讨GNA抗人肺腺癌A549细胞侵袭转移的作用及GNA影响血管生成的信号转导机制，为GNA的开发和应用提供理论依据。

1 试剂与材料

1.1 细胞株 人肺腺癌细胞株A549、HUVECs购于中国科学院上海细胞库。

1.2 试剂 GNA(分子量为630.8，纯度>98.0%，货号 B50231)：上海源叶生物有限公司提供；胎牛血清(货号 16140071)、DMEM高糖培养基(货号 12100046)：美国GIBCO公司；Matrigel胶(货号 356234)：美国BD公司；Boyden小室：美国康宁公司；聚碳酸酯膜孔径8.0 μm，NO检测试剂盒(货号 A012)：南京建成生物工程研究所；LY294002、L-NAME(货号 S0006)：江苏碧云天生物技术研究所；β-actin、eNOS抗体：美国Santa Cruz Biotechnology；NS-siRNA、第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN) siRNA(序列：5′-GGCUAAGUGAAGAUGACAATT-3′；5′-UUGUCAUCUUCACUUAGCCTT-3′)：上海吉玛生物工程公司；Lipofectamine 2000(货号 11668-019)：美国Invitrogen公司。

1.3 仪器 细胞培养箱、-80 ℃冰箱：日本Sanyo公司；倒置显微镜：日本Olympus公司；超净工作台：浙江苏净净化设备有限公司；灭菌锅：日本Hirayama公司；高速冷冻离心机：德国Eppendorf；倒置荧光显微镜(DMI-6000B)：德国徕卡公司；垂直电泳仪：上海天能科技有限公司。

2 方法

2.1 倒置显微镜下观察GNA对HUVECs形态的影响 取对数生长期的HUVECs，消化和收集，将细胞密度调整为6×10mL，接种于25 mL培养瓶。37 ℃、5% CO培养箱中培养24 h后，更换含有GNA的条件培养液，倒置显微镜下观察细胞并拍照。

2.2 改良的Boyden chamber检测GNA对HUVECs转移能力的影响 将Matrigel胶与预冷的无血清DMEM培养基按照1∶3的比例稀释加至Boyden小室中，每孔容积为50 μL，冰上操作。条件培养箱孵育5 h后，向上室加入200 μL的HUVECs悬液，下室中加入500 μL的A549细胞悬液，置于37 ℃，5% CO培养6 h后加药，继续培养24 h后取出小室，清洗上室残留细胞，4%多聚甲醛固定30 min后用0.1%结晶紫染液染色25 min，PBS洗涤3次，于倒置荧光显微镜下计数并拍照。

2.3 细胞划痕实验 于6孔板以每孔约2×10接种HUVECs，待细胞长满6孔板，用无菌200 μL加样枪头垂直于6孔板均匀划痕，用PBS轻洗细胞2～3遍后进行0 h取样，此为空白对照组,加入含不同浓度GNA的条件培养基，24 h后于倒置显微镜下取样。

2.4 NO水平的检测 采用硝酸还原酶法检测NO水平。不同药物组作用HUVECs 24 h后吸弃细胞培养液，收集细胞后超声裂解，2 000 r/min离心，收集上清，按照说明书的步骤操作，采用多功能酶标仪于550 nm处检测各组的吸光度。根据说明书提供的计算公式，计算细胞中NO的水平。

2.5 Western blot法检测GNA及LY29400预处理对HUVECs内磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)、p-PI3K、蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)、p-AKT表达水平的影响 各组HUVECs分别处理24 h后，无菌细胞刮刮取细胞后，收集，离心提取总蛋白，进行BCA蛋白定量。每组样品总蛋白25 μg，经12% SDS-PAGE电泳，分离蛋白。转膜后5%脱脂奶粉常温封闭3 h，一抗(稀释比例1∶1 000)4 ℃孵育过夜。TBST漂洗3次，每次10 min，二抗常温孵育2 h，再用TBST漂洗3次，每次10 min，加入ECL发光底物，曝光，采用平均灰度值比较各组蛋白的表达水平。

2.6 PTEN-siRNA转染细胞，琼脂糖凝胶电泳检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达水平 取对数生长期的A549细胞1×10/mL接种至6孔板，每孔加入1.8 mL无抗生素的培养基，37 ℃、5% CO培养箱孵育过夜。弃去6孔板中旧培养基，PBS洗2次，各孔加入不含抗生素培养液1.8 mL，按说明书操作配制好转染试剂并加入，轻轻混匀后培养箱培养6 h，倒置荧光显微镜下拍照，观察转染效率。提取总RNA，逆转录PCR，分别将VEGF、β-actin扩增产物(见表1)各5 μL与1 μL 6×SDS上样缓冲液混匀后，用移液器加样，电压90 V，电泳约40 min，取胶放置在凝胶成像系统上，紫外光下拍照，采用Biocapt MV软件测定吸光度(A)，采用Image J分析各组条带光密度值，并采用Graphpad 5.0作图。

表1 VEGF、β-actin基因引物表

3 结果

3.1 条件培养基的制备 将A549细胞2×10接种于75 mL培养瓶，12 h后取培养液，离心后取上清，再加入10%胎牛血清，-20 ℃冻存备用。使用前加入不同浓度的GNA，此为HUVECs的条件培养基。

3.2 倒置显微镜下观察GNA对HUVECs形态的影响 空白对照组中细胞贴壁牢固，折光性强；1 μmol/L GNA组细胞核固缩变圆，体积变小，贴壁细胞有少量出现漂浮现象；2 μmol/L GNA组少数细胞体积变大，折光性明显变弱，细胞呈现坏死状态；4 μmol/L GNA组大量细胞固缩变圆，漂浮于培养液中。见图1。

注：A.空白对照组；B.1.0 μmol/L GNA组；C.2.0 μmol/L GNA组；D.4.0 μmol/L GNA组

3.3 Boyden小室实验观察GNA对HUVECs迁移的影响 倒置荧光显微镜下观察发现，接种至Boyden小室上室中的细胞，5～6 h后开始贴附于凝固的Matrigel胶上，24 h后倒置荧光显微镜下观察，与空白对照组相比，2 μmol/L GNA组和50 μmol/L LY294002组可以降低细胞迁移数目(

P

<0.05)；与空白对照组及2 μmol/L GNA组相比，2 μmol/L GNA+50 μmol/L LY294002组能够显著降低细胞迁移数目(

P

<0.05)。见图2、表2。

注：A.空白对照组；B.2 μmol/L GNA组；C.50 μmol/L LY294002组；D.2 μmol/L GNA+50 μmol/L LY294002组

表2 Boyden小室实验观察GNA对HUVECs迁移的影响

3.4 细胞划痕实验观察GNA对HUVECs划痕愈合的影响 实验24 h后，GNA各处理组较空白对照组划痕愈合变慢(

P

<0.05)。结果表明，GNA可抑制HUVECs的划痕愈合，并且呈一定的剂量依赖性，见图3、表3。3.5 GNA对不同抑制剂处理的HUVECs中NO水平的影响 LY294002及L-NAME抑制剂作用HUVECs后，采用硝酸还原酶法测定NO含量，判断GNA对内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)活力的影响。实验结果显示，2 μmol/L GNA组能够显著降低NO水平(

P

<0.05)，与PI3K抑制剂LY294002组效果接近，且2 μmol/L GNA+50 μmol/L LY294002组NO水平更低(

P

<0.05)。见表4。与空白对照组比较，GNA组、L-NAME组NO水平显著降低(

P

<0.05)，且GNA+L-NAME组NO水平更低(

P

<0.05)。见表5。

图3 细胞划痕实验观察GNA对HUVECs划痕愈合的影响(结晶紫染色，10×20倍)

表3 细胞划痕实验观察GNA对HUVECs划痕愈合的影响

表4 GNA及PI3K抑制剂对细胞培养上清中NO水平的影响

表5 GNA及L-NAME对HUVECs上清中NO水平的影响

3.6 Western blot实验检测结果

3.6.1 Western blot法检测GNA对HUVECs内PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表达水平的影响 Western blot实验结果显示，GNA作用HUVECs后，p-PI3K和p-AKT蛋白表达水平随着药物浓度的增加呈剂量依赖性下降(

P

<0.05)；而PI3K和AKT蛋白表达水平基本不变。见图4、表6。3.6.2 GNA对LY294002预处理HUVECs相关蛋白表达水平的影响 为了进一步研究GNA对HUVECs迁移的信号转导通路，本研究检测PI3K/AKT的上游负性调控蛋白PTEN的表达水平，见图5。同时，采用PI3K特异性抑制剂LY294002和不同浓度的GNA作用HUVECs 24 h后，检测eNOS的含量变化，见图6。结果表明，细胞内PTEN蛋白的表达水平随着GNA浓度的增加而呈浓度依赖性增加(

P

<0.05)，见表7。2 μmol/L GNA作用HUVEC 24 h后，eNOS表达水平下降(

P

<0.05)，而PI3K抑制剂LY294002与GNA联合使用具有协同作用，促进eNOS蛋白表达水平进一步降低(

P

<0.05)，见表8。

注：A.空白对照组；B. 1μmol/L GNA组；C. 2 μmol/L GNA组；D. 4 μmol/L GNA组

表6 GNA对HUVECs内p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白相对表达水平的影响

注：A.空白对照组；B. 1 μmol/L GNA组；C. 2 μmol/L GNA组；D. 4 μmol/L GNA组

表7 GNA对HUVECs血管生成相关蛋白PTEN相对表达水平的影响

注：A.空白对照组；B. 2 μmol/L GNA组；C. 50 μmol/L LY294002组；D. 2 μmol/L GNA+50 μmol/L LY294002组

表8 GNA对HUVECs血管生成相关蛋白eNOS相对表达水平的影响

3.7 GNA对转染PTEN-siRNA的HUVEC中VEGF mRNA表达水平的影响 电泳图和Image J软件的分析结果显示,与空白对照组比较，GNA组能下调VEGF mRNA的表达水平(

P

<0.05)，而与GNA组比较，PTEN-siRNA组及PTEN-siRNA+GNA组VEGF mRNA的表达水平上调(

P

<0.05)。见图7、表9。

注：A.maker；B.空白对照组；C.GNA组；D.PTEN-siRNA组；E.PTEN-siRNA+GNA组

表9 GNA对转染PTEN-siRNA的HUVEC中VEGF mRNA相对表达水平的影响

4 讨论

PI3K家族是细胞内重要的信号传导分子，参与调控多种信号通路。PI3K/AKT信号通路在人类肿瘤谱中广泛失调，IA型PI3K和其下游分子AKT所组成的信号通路不仅调节肿瘤细胞的增殖和存活，与肿瘤的血管新生过程、侵袭转移行为也密切相关。PI3K/AKT信号通路受多种因子的调节，主要为负调节分子，如PTEN等抑癌蛋白。PTEN所编码的蛋白能使PIP3去磷酸化，阻断PI3K/AKT信号通路，从而促进细胞凋亡、抑制细胞增殖、抑制肿瘤血管新生和肿瘤迁移等作用。Jiang等研究表明，PI3K/AKT信号通路参与了血管生成，PETN可抑制这种效应。而PI3K/AKT通路与VEGF之间的关联在肿瘤血管生成中发挥了重要作用。研究表明，VEGF在多种肿瘤中高度表达，其通过诱导内皮细胞增殖、迁移，促进血管外基质降解等途径促进肿瘤血管生成。VEGF可提高血管通透性，促进血浆蛋白渗漏形成血管外纤维蛋白基质，为内皮细胞迁移提供网架；在多种细胞因子和蛋白酶协同作用下，使迁移出的内皮细胞延伸形成新生血管；经活化的蛋白水解酶降解肿瘤边缘细胞外基质，促使肿瘤细胞外渗而形成转移。

PI3K/AKT不仅是机体内重要的信号调控途径之一，并且是调控eNOS的关键信号途径之一。目前研究表明，第一个明确由AKT作用的促进血管形成的物质是eNOS。其表达与肿瘤侵袭和迁移、肿瘤血管分化和形成关系密切。AKT调节eNOS活性，与血管生成关系密切，在VEGF的作用下，活化的AKT和eNOS结合，eNOS被磷酸化丝氨酸激活，产生NO，从而引起血管舒张、血管重塑和血管生成。Ma等研究发现，PI3K/AKT的负调节分子PTEN可通过PI3K/AKT/VEGF/eNOS信号通路抑制肿瘤血管生成。

本课题组前期研究结果表明，GNA能够下调HUVECs的p-PI3K，p-AKT蛋白的表达水平且呈剂量依赖性，与对照组比较，差异具有统计学意义(

P

<0.05)。同时，采用PI3K特异性抑制剂LY294002处理细胞后，Western blot法检测表明VEGF的蛋白表达水平显著下调，提示GNA抑制血管生成与PI3K/AKT信号通路有关，且下游通路中VEGF起着非常关键的作用。本实验在此基础上，通过抑制剂LY294002预处理HUVECs，Western blot法检测HUVECs内PTEN、eNOS蛋白水平的表达变化，结果显示，PTEN蛋白表达水平随着GNA的浓度增加而增加，eNOS蛋白表达水平下降，且GNA 2 μmol/L与LY294002联用后作用更强。用Boyden chamber小室分析GNA以及LY294002对HUVEC转移能力的影响，发现GNA以及LY294002都能抑制细胞转移。细胞划痕愈合实验结果表明，不同浓度GNA均可抑制血管内皮细胞迁移，且呈剂量依赖性。采用LY294002和eNOS特异性抑制剂L-NAME处理细胞，硝酸还原酶法检测eNOS的表达水平，结果表明,2 μmol/L GNA和LY294002联用以及2 μmol/L GNA和L-NAME联用均能显著降低eNOS的含量；RT-PCR结果表明，沉默PTEN基因会促进VEGF表达水平的上调。

综上所述，GNA可能通过PTEN-PI3K/AKT/VEGF/eNOS通路影响HUVECs的迁移和血管形成。