青枯雷尔氏菌Ⅲ型分泌系统hrcN基因的功能分析

周大祥，龙泉洲，殷幼平，熊 书

（1.重庆大学生命科学学院/重庆市基因功能与调控重点实验室，重庆 400300；2.重庆三峡学院生物与食品工程学院，万州404120；3.重庆三峡医药高等专科学校基础医学部，万州 404120）

青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum是一种广泛分布的土传病原细菌，能够侵染50多个科，200多种植物，在全球范围内能够导致重大的经济损失[1]。由该菌引起的青枯病最早于1864年在烟草中报道，它的起源和早期传播仍未确定。青枯雷尔氏菌能够在潮湿的土壤或水体中存活数年[2]，当遭遇易感宿主，青枯雷尔氏菌就会进入植物根部，在根部皮层定殖，然后入侵木质部导管，最终通过导管系统迅速扩展到植物地上部，在宿主体内大量增殖引起导管堵塞与功能紊乱，出现萎焉症状。

hrcN基因作为植物病原菌T3SS结构基因之一，表达产物为ATP酶（ATPase），通过催化ATP的水解为效应蛋白的分泌提供能量。HrcN蛋白利用水解ATP产生的能量重塑多种蛋白底物，因此在膜融合、蛋白质修饰和降解等许多生理活动中发挥重要的作用[3]。Pozidis等[4]研究发现Pseudomonas syringas的HrcN是一种定位于外周膜上的ATP酶，能催化蛋白质易位。与其他T3SS相关的ATP酶一样，HrcN与F0/F1-ATPase亚基同源，包含介导ATP结合和水解的Walker框[5]。由于T3SS分子伴侣不能被分泌或转运，必须在效应蛋白分泌前从分子伴侣-效应蛋白复合体中释放出来，这种作用是由T3SS相关的ATP酶（InvC和HrcN）以ATP依赖的方式进行的。这些ATP酶也作为T3SS效应蛋白的去折叠酶发挥作用，使效应蛋白保持未折叠或部分未折叠的构象[6]。最近Gan等[7]研究发现T3SS效应蛋白的分泌和转位依赖于分子伴侣HpaB的C端区域，其C-端区域的缺失极大的减少了从HpaB与T3SS效应蛋白复合物中释放出游离效应蛋白的数量，其中，HrcN以ATP依赖的方式催化该反应。蛋白互作研究显示，HrcN与T3SS底物特异性开关蛋白HpaC以及分子伴侣HpaB相互作用，促进多种效应蛋白的分泌[8]。研究还发现HrcN可与HrcU和HrcV内膜蛋白互作[9]。

前期在扩增出青枯雷尔氏菌hrcN基因序列基础上，比对发现青枯雷尔氏菌hrcN基因与假单胞菌Pseudomonas syringas1448A、黄单胞菌Xanthomonas campestrisPXO99A和细菌性果斑病菌Acidovorax citrulliAac5相似性较高，其中与细菌性果斑病菌相似性最高。本研究以番茄青枯雷尔氏菌T3SS基因hrcN为研究对象，利用融合PCR技术和电转化获得青枯雷尔氏菌CBM613菌株的hrcN基因突变株和回补菌株，通过测定致病力、生长曲线、运动性检测和生物被膜形成能力等表型研究基因功能。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株与质粒：野生型番茄青枯雷尔氏菌CBM613菌株由西南大学植物保护学院馈赠，为强致病力菌株；TOP10化学感受态细胞购自美国Thermo公司；pMD19-T载体购自日本TAKARA公司；pJQ200SK、pCVD442和pRK415质粒载体本实验室保存。

供试植物：番茄为感病品种中蔬5号，28 ℃～30 ℃光照培养箱培养，光周期16L﹕8D，相对湿度90%，种苗培养至5～6片叶时备用。

试剂及仪器：NA（Nutrient Agar）培养基（牛肉浸膏3 g，酵母浸膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，琼脂20 g，蒸馏水加至1000 mL，pH为6.8～7.0）、NB（Nutrient Broth）培养基（NA培养基不加琼脂）、LB（Lysogeny Broth）培养基（蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，加入双蒸水定容到1000 mL，pH为7.0）、TSB（Tryptic Soy Broth）培养基（胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，加入双蒸水定容到1000 mL，pH为7.2）、Boucher基础液体培养基（KH2PO413.6 g，(NH4)2SO42 g，FeSO4·7H2O 0.5 mg，L-谷氨酸2.9 g，加入双蒸水定容到1000 mL，用KOH调节pH至7.0）、半固体SMM（Supplemental minimal medium）培养基（葡萄糖0.1 g，蛋白胨0.1 g，EDTA-2Na 38 mg，琼脂3.5 g，磷酸盐缓冲液（pH 7.0）10 mL，加入双蒸水定容到1000 mL）、CPG（Casamino acids Peptone Glucose）培养基（酵母粉1 g，葡萄糖10 g，牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，加入双蒸水定容到1000 mL，pH为7.0）；细菌基因组DNA提取试剂盒、细菌质粒提取试剂盒购自德国QIAGEN公司；PrimeSTAR Max Premix (2×)购自日本TAKARA公司；TaqDNA polymerase、T4 DNA ligase、SmaI、XbaI、EcoR I和10×Tango buffer购自立陶宛MBI公司；DMSO购自德国Biofroxx公司；其他试剂皆为国产分析纯。5910R高速冷冻离心机，德国eppendorf公司；C1000 PCR仪、核酸电泳仪、Versadoc 1000凝胶成像系统、MicroPulser电穿孔转化仪，美国BIO-RAD公司。

1.2 试验方法

1.2.1 突变株及回补菌株的获得 参考青枯雷尔氏菌GMI1000hrcN基因设计引物hrcN-F（5′-GGCTGAT ATCGGATCCATGACCCATCTCGCGCTG-3′）和hrcN-R（5′-GGTGGTGGTGCTCGATCATGCCAGTGCG ATCTCGTC-3′）。提取CBM613菌株DNA，PCR扩增。将回收的DNA片段连接到T载体，转化DH5α大肠杆菌，挑取PCR验证过的阳性克隆菌株测序。利用Krogh等[10]的方法预测分子量、PI、跨膜区域和亲水性；利用深度神经网络SignalP 5.0[11]预测信号肽；利用https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw在线比对hrcN的基因和蛋白质序列； Motif预测蛋白功能采用Nicolas等[12]的方法；利用http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/GnegmPLoc.cgi 在线预测蛋白亚细胞定位。

根据hrcN基因及上下游序列、庆大霉素（Gm）抗性基因序列设计引物（表1），首先扩增出hrcN基因上、下游同源重组臂序列，从pJQ200SK质粒上扩增Gm抗性基因编码序列；然后利用融合PCR技术构建打靶序列片段（hrcN基因上游-Gm-hrcN基因下游），经SmaI酶切完成打靶载体pCVD442-ΔhrcN::Gm的构建；最后通过同源重组和电转化大肠杆菌，与受菌体（CBM613菌株）结合，在含Gm的NB培养基上筛选突变株，并用表1中的鉴定引物鉴定突变株。

表1 hrcN基因敲除所需引物Table 1 Primers used in hrcN gene knockout

通过hrcN-1F/hrcN-1R扩增出hrcN片段，经XbaI/EcoR I酶切后克隆入pRK415质粒对应的酶切位点，经连接和转化TOP10化学感受态细胞后，铺四环素（Tc）平板筛选阳性克隆，完成pRK415-hrcN基因回补质粒构建。回补质粒pRK415-hrcN电转化大肠杆菌，与受体菌（CBM613/ΔhrcN）结合，在含Tc的TSB培养基上筛选回补菌株，用pRK415-F/pRK415-R引物进行PCR鉴定回补菌株。

1.2.2 表型测定 番茄感病品种为中蔬5号，按照He等[13]根部接种法接种菌株CBM613、CBM613/ΔhrcN突变株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回补菌株各接种15株，3次重复。按照Meng等[14]的方法计算青枯病的病情指数；分别挑取3种菌株于NB培养基中，28 ℃、220 r/min摇床培养获得菌悬液，10000 r/min离心5 min收集菌体。按照Kanda等[15]方法测定600 nm的吸光度值，计算生长曲线；取浓度为3×108CFU/mL的野生型菌株、突变株和回补菌株菌液各5 μL，3种菌株的泳动性检测按照Kelman等[16]方法测量菌落直径。3种菌株的生物被膜的测定参考Meng等[17]的方法测定490 nm的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 hrcN基因的扩增结果

PCR产物在1%琼脂糖凝胶进行电泳，图1结果显示，条带清晰而且特异，大小1300 bp左右。将该条带回收，然后连接到T载体并且转化大肠杆菌，得到的阳性克隆进行菌落PCR鉴定并测序，测序发现基因长度为1320 bp，共编码439个氨基酸，结果表明已扩增出番茄青枯雷尔氏菌CBM613的hrcN基因，DNA序列已提交到GenBank（Gene ID：No.42594317）。预测HrcN蛋白分子量为47.54 kD，PI为4.97，无信号肽（预测有信号肽概率为1.734%），无跨膜区域，整体呈弱亲水性（图2）。Motif预测结果显示该蛋白为ATP酶，蛋白亚细胞定位预测其定位于细胞内膜和细胞质。

图1 菌株CBM613 hrcN基因的扩增Fig. 1 PCR amplification production of strain CBM613 hrcN gene

图2 菌株CBM613 HrcN蛋白亲水性预测Fig. 2 Hydrophilicity prediction of HrcN in strain CBM613

通过与菌株GMI1000的hrcN基因序列进行在线比对发现，该基因一致性为99.6%，在青枯雷尔氏菌中非常保守。青枯雷尔氏菌与参比菌株GMI1000hrcN基因相比共有5个SNP位点，具体突变信息为 216：A-G GTA-GTG val；609：T-C CGT-CGC arg；879：T-C CGT-CGC arg；907：G-A GCC-ACC ala-thr；999：T-C GGT-GGC gly。只有907位氨基酸发生改变（由GMI1000的丙氨酸突变为苏氨酸），其他5个SNP都是无意突变。

2.2 hrcN基因打靶序列片段的构建

突变体筛选的抗性基因采用Gm抗性基因（长度832 bp），hrcN基因上游同源重组臂和下游同源重组臂长度分别为799和742 bp，利用融合PCR技术构建打靶序列片段（上游同源重组臂-Gm抗性基因编码序列-下游同源重组臂），长度为2373 bp。图3电泳图显示，泳道1中有4条带，其中最亮的条带为打靶序列片段，电泳结果表明成功构建了打靶序列片段。

图3 hrcN基因打靶序列片段的构建Fig. 3 Construction of targeting sequence of hrcN gene

2.3 hrcN基因突变株的构建

将供菌体和受菌体（CBM613菌株）混合结合后，抗性平板上培养单克隆，随机挑选 10个单克隆，用hrcN基因内部引物进行PCR鉴定。如发生二次重组，则这对引物无扩增产物，否则有227 bp的特异性扩增条带。图4结果显示：第1～6号克隆为阴性扩增，表明hrcN基因可能已被敲除；7～10号克隆有227 bp的特异性条带，说明没有发生二次重组，hrcN基因未能成功敲除。

图4 菌株CBM613 hrcN突变体内部引物鉴定Fig. 4 PCR analysis of hrcN-in of CBM613/ΔhrcN deletion mutant

将上述1号克隆再次进行hrcN基因内部引物鉴定，为阴性扩增后用hrcN基因外侧引物进行进一步的鉴定。图5显示，条带2为原始菌株的扩增产物长度为2739 bp；条带1为Gm抗性基因替换菌株的扩增产物长度为2580 bp，同时测序结果显示局部序列同设计。该克隆子为最终的hrcN基因被Gm抗性基因替换的阳性克隆，称为：CBM613/ΔhrcN。

图5 菌株CBM613 hrcN突变体外侧引物鉴定Fig. 5 PCR analysis of hrcN-out of CBM613/ΔhrcN deletion mutant

2.4 回补菌株的筛选及鉴定

在Tc平板上的阳性克隆用pRK415-F/pRK415-R载体引物对进行PCR鉴定。当hrcN克隆入设计位点后，这对引物的扩增产物长度为1634 bp。图6结果显示，1～6号全部克隆都有预期长度的特异片段扩增，取第1号克隆的PCR产物进行测序，结果显示与设计一致。经转化CBM613/ΔhrcN受体菌后，涂布筛选出阳性克隆，pRK415-F/pRK415-R引物进行PCR扩增，有预期长度的特异片段扩增，表明青枯雷尔氏菌突变株hrcN基因回补成功。

图6 hrcN基因回补菌株鉴定Fig. 6 PCR analysis of the complemented strain of hrcN gene

2.5 hrcN基因对青枯雷尔氏菌致病力的影响

hrcN基因敲除后，在NA培养基上28 ℃生长5 d，突变株和回补菌株菌落形态与野生型菌株相比无明显变化（图7）。进一步将野生型菌株、hrcN基因突变株和回补菌株采用根部接种法接种番茄测定致病力结果表明，野生型菌株接种番茄植株后，在第4 d开始发病，突变株在第5 d才开始出现萎蔫症状。图8为野生型菌株、突变株和回补菌株在接种后第7 d的发病情况可知，野生型菌株的病情指数为1.87，突变株仅为0.27，下降了85.56%；相比野生型菌株，回补菌株病情指数为1.67，突变株的致病力能够部分恢复。接种12 d后，野生型菌株的病情指数高达3.49，而突变株仅为1.89，回补菌株有所恢复为3.18。接种试验结果显示：突变株较野生型菌株的致病力下降，病程延长，但并未丧失致病力，表明hrcN基因是青枯雷尔氏菌致病性相关的重要基因。

图7 菌株CBM613、hrcN基因突变株CBM613/ΔhrcN和回补菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN的菌落形态Fig. 7 Colony morphology of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and BM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains

图8 菌株CBM613、hrcN基因突变株CBM613/ΔhrcN和回补菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN的致病力测定Fig. 8 Evaluation of the pathogenicity of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains

2.6 hrcN基因对青枯雷尔氏菌生长曲线的影响

分别将CBM613菌株、CBM613/ΔhrcN突变株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回补菌株在Boucher基础液体培养基（贫营养培养基）和 CPG培养基（富营养培养基）中进行生长曲线测定，野生型菌株、突变株和回补菌株在富营养培养基上的生长速率差异不明显（图9）。

图9 菌株CBM613、hrcN基因突变株CBM613/ΔhrcN和回补菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN在富营养培养基上的生长曲线Fig. 9 The growth condition of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains in the CPG medium

3种青枯雷尔氏菌在贫营养培养基上培养18 h后，突变株比野生型菌株生长更快（图10），生长速率开始出现明显差异（P＜0.05），回补菌株与野生型菌株生长速率无明显差异。

图10 菌株CBM613、hrcN基因突变株CBM613/ΔhrcN和回补菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN在贫营养培养基上的生长曲线Fig. 10 The growth condition of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains in the mimimal medium

2.7 hrcN基因对青枯雷尔氏菌运动性的影响

利用半固体SMM培养基，研究CBM613菌株、CBM613/ΔhrcN突变株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回补菌株的运动性。通过测量菌落直径，野生型菌株、突变株和回补菌株的运动能力没有显著差异，结果表明hrcN基因敲除没有影响青枯雷尔氏菌的运动性（图11）。

图11 菌株CBM613、hrcN基因突变株CBM613/ΔhrcN和回补菌株BM613/ΔhrcN-p-hrcN的运动性Fig. 11 The mobility of of CBM613, CBM613/ΔhrcN deletion mutant and CBM613/ΔhrcN-p-hrcN complemented strains

2.8 hrcN基因对青枯雷尔氏菌生物被膜形成能力的影响

通过对比菌株CBM613、CBM613/ΔhrcN突变株和CBM613/ΔhrcN-p-hrcN回补菌株的生物被膜形成能力，结果发现3种青枯雷尔氏菌株的生物被膜形成能力随培养时间增加而增强，突变株相比于野生型菌株，生物被膜形成能力显著减弱，而回补菌株与野生型菌株相比差异不明显（图12）。

3 讨论

作为植物病原菌分泌毒力因子的重要装置，分泌系统一直以来都是病原细菌研究的热点，其中 T3SS在各型分泌系统中研究较多[18]。革兰氏阴性动植物病原菌利用T3SS将效应蛋白注入真核宿主细胞中，跨膜T3SS装置和ATP酶有关，ATP酶可为分泌过程提供能量。hrcN基因表达产物为ATP酶，该酶在细菌内膜上形成一个与分泌器相关的环状结构，并在效应蛋白的分泌过程提供能量，对T3SS和细菌的致病性是必不可少的。hrcN基因敲除后对致病力等表型的影响还未见报道，但与HrcN蛋白具有相同功能的InvC蛋白基因敲除后，突变株较野生型菌株毒力与定殖率皆显著降低[19]。InvC与大肠杆菌F0/F1-ATPase具有催化功能的β亚基氨基酸序列相似程度很高，invC基因突变后其蛋白水解ATP的能力丧失，突变体分析进一步鉴定出InvC参与核苷酸水解和膜结合的氨基酸序列[20]。本研究以青枯雷尔氏菌T3SS的hrcN基因为研究对象，该基因是AAA+ATPase家族成员之一，产物为ATP酶。利用同源重组技术得到了hrcN基因部分缺失突变株，发现突变株较野生型菌株的致病力下降，病程延长，与青枯雷尔氏菌T3SS效应蛋白基因Rip56敲除后致病力测定结果相似[21]。结果表明hrcN是青枯雷尔氏菌的致病基因之一，影响T3SS效应蛋白的分泌。

接种试验表明，hrcN基因突变株导致青枯雷尔氏菌对番茄的致病力下降，为了充分研究基因功能，进一步对其生长速率、生物被膜和运动性等基础生物学特性进行探究。Kanda等[15]测定了烟草青枯雷尔氏菌的生长曲线结果显示，不管在贫营养培养基或者富营养培养基上，野生型菌株与hrpB基因突变株生长速率基本一致。本试验发现野生型菌株、hrcN基因突变株和回补菌株在富营养培养基上的生长速率基本一致，在贫营养培养基上，hrcN基因突变株比野生型菌株生长更快，这与Kanda等[15]的研究结论不一致。在贫营养培养基上突变株比野生型菌株生长更快的文献还未见报道，对番茄青枯雷尔氏菌hrcN基因突变后的代谢是否产生变化尚未可知，需进一步通过组学等技术探究其原因。

病原菌通过自身的运动获得了更大的生存空间，鞭毛等器官可为其提供运动能力。通过运动性病原菌对有利或不利的环境快速做出响应，避开有害的环境，接近有利的宿主附近，扩大生存范围。运动性能够促使植物病原菌在侵染初期识别、吸附和入侵宿主植物并进行定殖和扩展，提高病原菌的致病能力，而运动性对病原菌入侵植物后的阶段不起作用[22]。此次研究发现hrcN基因敲除后对番茄青枯雷尔氏菌的运动能力没有影响，而敲除spoT和relA基因后对青枯雷尔氏菌的运动能力影响很大[23]。

生物被膜作为保护细菌的生物活性膜，能够形成在非有机体和有机体的表面。其主要成分为蛋白质、胞外多糖、脂质和胞外DNA等，是一种复杂的三维结构。当环境发生改变，细菌形成生物被膜可以保持水分，通过调节代谢降低营养物质的消耗，从而有助于细菌存活。细菌形成的生物被膜将自身包围，处于其中的细菌相互彼此接触，影响许多微生物的生存与定殖，比如植物病原细菌通过昆虫传播、直接侵入或从受伤部位入侵植物组织，利用生物被膜增强在植物根、茎、叶和种子等部位的定殖与生存，通过阻塞植物木质部导管和维管束组织，引起组织损伤，破坏被感染的组织，造成植物萎蔫。玉米细菌性萎蔫病病原菌Pantoeastewartii、马铃薯软腐病病原菌Pectobacterium carotovorumbrasiliense和油菜黑腐病病原菌Xanthomonas campestris等的生物被膜能够阻塞植物木质部导管和维管束组织，引起组织损伤，破坏被感染的组织，造成植物萎蔫[24-26]。研究还发现，柑橘溃疡病病原菌Xanthomonas citri的T3SShrpB缺失突变株不能在柑橘叶片表面聚集，丧失生物被膜的形成能力[27]，革兰氏阴性菌Acidovorax citrulli的4个Ⅵ型分泌系统基因突变株在甜瓜种子上形成生物被膜和定殖的能力降低[28]，某些分泌系统与生物被膜形成和细胞聚集有关。本研究发现hrcN基因突变株相比于野生型菌株，生物被膜形成能力显著减弱，结合hrcN基因突变株致病力降低，说明hrcN基因敲除后，番茄青枯雷尔氏菌生物被膜形成能力降低，番茄木质部导管阻塞程度减弱，萎蔫减轻，病情指数降低。本研究为后续探究青枯菌 T3SS的功能及其致病机制提供基础，研究发现青枯雷尔氏菌hrcN基因敲除后菌株毒性减弱，未来可以作为青枯病的生防菌株，具有一定的应用价值。