一株绿针假单胞菌桔黄亚种在防治番茄匍柄霉叶斑病中的应用

黄艺烁，谢学文，石延霞，柴阿丽，李 磊，李宝聚

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

番茄匍柄霉叶斑病致病菌包括茄匍柄霉Stemphylium solaniWeber和番茄匍柄霉Stemphylium lycopersici（Enjoji）Yamamoto[1]，主要危害番茄叶片，严重时蔓延至茎蔓、果实。病斑初为褐色小点，逐渐扩大呈圆形或近圆形，发病后期易穿孔破裂，造成严重损失[2]。现阶段该病害的防治措施主要依赖化学防治，但大量施用化学农药造成如农药残留、环境污染、菌株抗药性等问题日益凸显。近年来，生物防治由于其安全性及高效、经济、环保等优点，已成为研究热点[3]。

假单胞菌属Pseudomonasspp.细菌广泛分布于植物根际土壤，可以产生多种具有抑菌作用的次生代谢物，包括吩嗪类物质、藤黄绿脓菌素（pyoluteorin，Plt）、硝吡咯菌素（pyrrolntrin，Prn）、2,4-DAPG（2,4-diacetylphloroglueinol，Phl）、脂多肽类及其衍生物等，在防治病害中发挥着重要作用[4]。此外，假单胞菌还可以产生植物激素IAA、嗜铁素等物质，促进植物的生长[5]，因而受到各国研究者的关注，是国内外研究最早、报道最多的一类生防菌[6]。多年来，有关假单胞菌属生物防治的研究多集中在其根际促生作用上[7]，而近年来一些学者用假单胞菌成功防治了小麦[8]、草莓[9]、小白菜[10]和番茄[11]等多种植物的侵染性病害，极大地扩展了假单胞菌的应用范围。目前，利用生防假单胞菌防治番茄匍柄霉叶斑病鲜有报道，本研究采集番茄匍柄霉叶斑病发病地块土壤，旨在分离获得对番茄匍柄霉具有高效拮抗作用的菌株。

本文采用稀释涂布平板法，从四川番茄根际土壤分离筛选到一株具有广谱拮抗活性的生防细菌YS05，结合形态学特征、生理生化特性、Biolog测定和多基因系统发育树，明确了其分类地位，初步揭示其生防作用机理。同时测定了该菌株产抗生素能力、挥发性物质抑菌活性及在离体和活体盆栽条件下对番茄匍柄霉防治效果，为该菌株的进一步开发和应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试番茄品种 番茄品种“齐达利”，购于先正达生物科技（中国）有限公司。

1.1.2 供试菌株 番茄匍柄霉菌Stemphylium lycopersici（Enjoji）Yamamoto、炭疽菌Colletotrichumspp.、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、多主棒孢菌Corynespora cassiicola、辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、茄病镰刀菌Fusarinm solani、茄链格孢菌Alternaria solani、西瓜壳二孢Ascochyta citrullina、密执安棒杆菌密执安亚种Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis、葡萄土壤杆菌Agrobacterium vitis、丁香假单胞番茄致病变种Pseudomonas syringaepv. tomato，以上菌株均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所分离并保存。

1.1.3 供试培养基 King′s B培养基：蛋白胨20.0 g，甘油10.0 mL，MgSO4·7H2O 1.5 g，K2HPO41.5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0±0.2；Nutrient Broth培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉 3.0 g，NaCl 5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0±0.2； Potato Dextrose Agar培养基：去皮马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1000 mL；WA培养基：5 g琼脂，1000 mL蒸馏水。

1.1.4 供试药剂 50%异菌脲可湿性粉剂，江苏省苏州富美实植物保护剂有限公司生产（登记号：PD20151441）；8亿芽胞/g蜡质芽胞杆菌可湿性粉剂，山东泰诺药业有限公司（登记证：PD20094534）；80亿芽胞/mL地衣芽胞杆菌水剂，广西金燕子农药有限公司（登记证号：PD20140122）；46%氢氧化铜水分散粒剂，美国杜邦公司（登记证号：PD20110053）；33.5%喹啉铜悬浮剂，山东奥胜生物科技有限公司（登记证号：PD20200743）；10%多抗霉素可湿性粉剂，山东省德州祥龙生化有限公司（登记证号：PD20100857）；50%异菌脲可湿性粉剂，江苏省苏州富美实植物保护剂有限公司（登记号：PD20151441）。

1.2 拮抗菌株分离、纯化

采集四川健康番茄植株根际土壤，采用稀释涂布平板法[12]，将土壤样品进行梯度稀释，取100 μL稀释浓度为10-4、10-5、10-6的悬浮液涂布于KB固体培养基，28 ℃培养24 h[13]。对单菌落进行划线纯化3～5次，待菌落形态稳定后保存备用[14]。

1.3 拮抗菌株的筛选

采用平板对峙法测定上述分离纯化细菌对番茄匍柄霉的抑制率[15]。在PDA平板中心放置一个直径5 mm的番茄匍柄霉菌饼，采用十字交叉法将5 μL OD600为0.8待测菌株菌悬液滴加距皿中心2.5 cm处，以不加待测菌株为对照，28 ℃培养5～7 d，每处理 3次重复。待空白对照菌株生长至平板边缘进行调查，用抑制率表示[16]。抑制率（%）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/对照菌落直径×100。

1.4 菌株YS05的鉴定

1.4.1 菌株形态特征观察及生理生化指标测定 使用灭菌牙签挑取菌株YS05单菌落接种于KB固体培养基上，28 ℃培养24 h。菌株形态特征观察和生理生化指标测定参考《常见细菌系统鉴定书册》[17]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[18]。

1.4.2 Biolog测定 挑取YS05单菌落接种至KB培养基试管斜面上，28 ℃恒温培养24 h，使用BIOLOG GENⅢ试剂盒（按照试剂盒说明书操作）对其进行唯一碳源利用的测定。

1.4.3 菌株YS05多基因系统发育树构建 利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒，小量提取菌株YS05基因组DNA为模板，选择16S rDNA、gyrB、rpoB和rpoD等保守基因进行PCR扩增并测序[19]（表1）。所得PCR产物由北京博迈德生物公司进行测序。使用MEGA 7.0、Sequence Matrix、Seaview4等软件对测序结果进行分析，构建最大似然法系统进化树，分析其分类地位[14]。

表1 构建多基因系统发育树引物信息Table 1 Primers of phylogenetic tree

1.5 菌株YS05抑菌谱测定

采用平板对峙法测定菌株YS05对9种病原真菌抑制效果，操作步骤同1.3。采用双层培养法[21]测定菌株YS05对3种病原细菌抑制效果。将5 µL OD600为0.8的菌株YS05菌悬液接种在KB平板中心，28 ℃培养24 h后用3 mL氯仿熏蒸灭活，使用5 mL含有病原细菌的WA培养基作为上层。28 ℃培养48 h后测量抑菌圈直径，计算抑菌率，每个处理 3次重复。抑制率（%）＝（对照菌落直径—处理菌落直径）/对照菌落直径×100。

1.6 菌株YS05生防机制分析

1.6.1 蛋白酶的检测 在脱脂牛奶培养基中心位置接种5 µL OD600为0.8的菌株YS05菌悬液，28 ℃培养24 h后观察消解圈。每个处理3次重复[22]。

1.6.2 HCN的检测 Whatman滤纸剪成5 mm×25 mm的纸条，分别称取25 mg copper (Ⅱ) ethylacetoacetate和25 mg 4-4’-methylenebis-(N, N-dimethylaniline)溶于10 mL氯仿中，镊子灭菌后将Whatman滤纸条在上述溶液中完全浸湿，晾干，于9 cm玻璃培养皿中保存备用[12]。

1.6.3 抗生素耐受性测定 测定菌株YS05对10种抗生素的耐受性（表2），在15 mL无菌管中加入3 mL含抗生素KB液体培养基，接种1% OD600为0.8的菌株YS05菌悬液于摇菌管中，设置未加抗生素空白对照，摇培24 h，观察菌株对抗生素的耐受性，每个处理3次重复[23]。

表2 抗生素溶液配制Table 2 Preparation of antibiotic solution

1.6.4 菌株YS05抗生素基因特异性引物扩增 为分析菌株YS05合成抗生素能力，选择吩嗪、2,4-DAPG、硝吡咯菌素、藤黄绿脓菌素、2-羟基吩嗪等抗生素合成基因特异性引物进行PCR扩增（表3），PCR程序和条件参照相应文献。利用荧光假单胞菌2P24作为对照，PCR产物测序验证与抗生素生物合成序列一致性[26]。

表3 抗生素基因及引物序列信息Table 3 Antibiotic gene and primer sequence information

1.7 菌株YS05挥发性物质抑菌活性测定

取菌株YS05单菌落接种在液体KB培养基中，28 ℃摇培24 h，调整其OD600为0.8备用。在二分皿中加入PDA培养基，灭菌牙签蘸取菌株YS05种子液平板一侧划线，对应一侧加入5 mm病原真菌菌饼，置于28 ℃培养箱中倒置培养，未加生防菌作为对照[27]。观察到空白对照病原菌生长至平板边缘处进行调查，测定病原菌生长直径并计算抑制率，每个处理重复3次。抑制率（%）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/对照菌落直径×100。

1.8 菌株YS05与6种药剂对番茄匍柄霉离体叶片防效测定

采用贴菌片法测定菌株YS05和其他6种药剂对番茄匍柄霉离体叶片防效，测定步骤参照文献[28]，将5 mm真菌菌饼置于番茄叶片正面，28 ℃、光暗交替条件下培养3 d。使用OD600为0.8的菌株YS05菌悬液稀释100倍后喷雾接种于含真菌菌饼的番茄叶片上，清水作为空白对照，选择6种对照药剂测定对番茄匍柄霉离体防效。每个处理6个叶片，3次重复。处理后7 d调查发病情况，计算病情指数和防治效果。按照《农药田间药效试验准则》中的病害分级标准，病情按病斑面积占叶片比例分级：0级为 0；1级为1%～5%；2级为6%～10%；3级为11%～25%；4级为26%～50%；5级为50%以上[29]。病情指数＝∑（各级病叶数×病级数）/（调查总叶数×最高病级数）×100，防治效果（%）＝（对照组病情指数－处理组病情指数）/对照病情指数×100。

1.9 菌株YS05防治番茄匍柄霉活体盆栽防治效果测定

采用喷雾接种法将15 mL浓度为1×108cfu/mL的番茄匍柄霉菌悬液接种于5片真叶的番茄幼苗上，于28 ℃下保湿24 h后，将OD600为0.8的菌株YS05菌悬液稀释100倍后，喷雾接种于处理植株，以50%异菌脲可湿性粉剂和清水作为对照。每个处理3个重复，每个重复处理8棵番茄幼苗，病情指数和防治效果计算方法参照1.8。

1.10 数据统计与分析

采用Excel 2016软件对数据进行统计分析和绘图，采用SPSS 20软件对数据进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌株的分离筛选

从四川健康番茄根际土壤中共分离获得236株细菌，利用平板对峙法获得23株对番茄匍柄霉具有抑制效果的拮抗细菌，对其编号为YS01～YS23。试验结果表明，23株拮抗细菌对番茄匍柄霉具有一定的抑制效果，菌丝生长被抑制，其中菌株YS05抑制效果最高，抑制率达68.91%（表4）。

表4 23株假单胞菌对番茄匍柄霉拮抗效果测定Table 4 Inhibition rate of 23 strains of antagonistic bacteria against Stemphylium lycopersici in tomato

2.2 菌株YS05的鉴定

菌株YS05在KB平板中正面呈现乳白色，背面为淡黄色，电镜下观察菌株形态为杆状，鞭毛单个极生，大小为（0.8～1.1）μm×（1.2～2.7）μm（图1）。Biolog测定菌株YS05可利用α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖等碳源，不可利用3-Methyl 葡萄糖、肌苷、D-山梨醇、D-甘露醇等碳源。菌株YS05生理生化指标的测定结果表明，菌株YS05的耐盐性、明胶液化、V-P反应、淀粉水解和硝酸盐还原利用等试验结果与绿针假单胞菌HL5-4和绿针假单胞菌Pa40的反应特征一致，初步确定其为绿针假单胞菌属细菌（表5）。

图1 菌株YS05形态特征观察Fig. 1 Observation on morphological of strain YS05

表5 生理生化特征鉴定结果Table 5 The physiological and biochemical reaction of bacterial strain YS05

经PCR扩增后，得到菌株YS05 16S rDNA、gyrB、rpoB和rpoD基因序列，构建YS05多基因系统进化树，该菌株与绿针假单胞菌桔黄亚种模式菌株P. chlororaphissubsp.aurantiacaLMG 21630聚在一个分支。结合形态和生理生化特征，鉴定菌株YS05属于绿针假单胞菌桔黄亚种（图2）。

图2 菌株YS05基于16S rDNA、gyrB、rpoB和rpoD基因序列的系统进化树Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA, gyrB, rpoB and rpoD gene sequences of strain YS05

2.3 菌株YS05抑菌谱的测定

菌株YS05可以有效抑制灰葡萄孢菌、多主棒孢菌、辣椒疫霉、立枯丝核菌、炭疽菌、茄链格孢菌和番茄匍柄霉菌等7种真菌抑制率大于50%，对茄病镰刀菌和西瓜壳二孢抑制率分别为21.4%和7.73%。菌株YS05对病原细菌也有较好的抑制效果，对丁香假单胞番茄致病变种和葡萄根癌菌抑菌率均在50%以上（表6）。

表6 菌株YS05对病原菌的抑菌效果Table 6 The effects of strain YS05 on pathogens

2.4 菌株YS05生防机制分析

菌株YS05在脱脂牛奶培养基中有透明圈产生（图3A）；接种菌株YS05离心管中试纸条变蓝（图3B），证明其代谢产物中含有蛋白酶和HCN。菌株YS05对氨苄青霉素、氯霉素、万古霉素、羧苄青霉素、链霉素、奇霉素等抗生素耐受，对卡那霉素、利福平、四环素、庆大霉素等4种抗生素不耐受。抗生素特异性引物PCR扩增结果表明，菌株YS05含有编码合成吩嗪-1-羧基（phenazine-1-carboxilic acid, PCA），硝吡咯菌素（pyrrolnitrin, Pln）基因，未扩增出2,4-DAPG（2, 4-diacetylphloroglucinol, DAPG）、藤黄绿脓菌素（pyoluteorin, Plt）和2-羟基吩嗪（2-hydroxylated phenazine, 2-OH-PHZ）基因（图3C）。

图3 菌株YS05生防机制分析Fig. 3 Analysis of biocontrol mechanism of strain YS05

2.5 菌株YS05挥发性物质抑菌活性测定

测定菌株YS05挥发性物质对病原真菌抑制效果结果表明，菌株YS05挥发性物质对立枯丝核菌和西瓜壳二孢效果较好，抑制率分别为43.95%和49.53%，而对茄病镰刀菌抑制率较低为10.43%（表7）。

表7 菌株YS05挥发性物质抑制效果Table 7 Inhibitory effect of volatile compounds of strain YS05

2.6 菌株YS05与6种药剂对番茄匍柄霉离体叶片防效

菌株YS05菌悬液和6种药剂对番茄匍柄霉离体叶片的防治试验结果表明，7个处理的病情指数均显著低于清水对照，菌株YS05菌悬液稀释100倍液后，对番茄匍柄霉叶斑病防治效果达到71.52%，显著高于其他6种药剂防治效果（P＜0.05）（表8）。

表8 菌株YS05与6种药剂对番茄匍柄霉离体叶片防效Table 8 Control efficiency of YS05 strain against gray leaf spot of tomato

2.7 菌株YS05防治番茄灰叶斑匍柄霉活体盆栽防治效果

清水对照处理接种番茄匍柄霉菌7 d后叶片上出现明显的病斑，菌株YS05菌悬液稀释100倍液后，对番茄匍柄霉叶斑病的防治效果达到61.27%，显著高于药剂对照50%异菌脲可湿性粉剂处理防效57.68%（P＜0.05）（表9）。

表9 菌株YS05对番茄匍柄霉盆栽防效测定Table 9 Control efficiency of strain YS05 against gray leaf spot of tomato by potted test

3 讨论

本研究从四川健康番茄植株根际土壤中分离到一株对番茄匍柄霉菌具有良好拮抗效果的生防细菌YS05，经鉴定属于绿针假单胞菌桔黄亚种。绿针假单胞菌桔黄亚种属于假单胞菌属、绿针假单胞菌种细菌[30]，

据报道绿针假单胞菌桔黄亚种对多种植物病害均有较好的防治效果。Jiao等[12]分离获得一株绿针假单胞菌桔黄亚种Pa40，可有效控制小麦纹枯病致病菌禾谷丝核菌Rhizoctonia cereali的生长；Rovera等[31]发现绿针假单胞菌桔黄亚种SR1可有效地抑制大豆炭腐病Macrophomina phaseolina的发生，并显著增加大豆茎、根长度及茎和根的干重；Hu等[32]从小麦田中分离获得一株可高产PCN的菌株Pcho10，可防治小麦赤霉病Fusarium graminearum。本研究发现，菌株YS05对9种病原真菌和3种病原细菌在离体条件下均有抑制效果，已报道绿针假单胞菌常用于防治真菌性病害，鲜有对细菌性病害具有防治效果，因此该生防菌具有一定的开发潜力。

生防菌防治植物病害主要的作用机理为抗生作用、营养和位点竞争及诱导植物抗性等[33]。不同的菌株产生的抗生素的种类和数量可能会不同，因此不同的假单胞菌对不同的病原菌具有抑制活性，且抑制程度也不相同[34]。绿针假单胞菌Pa40含有编码参与吩嗪-1-羧酸、2-羟基吩嗪和硝吡咯菌素等合成基因[12]；菌株2P24和CPF-10中均可扩增到抗生素2,4-DAPG[12]；假单胞菌M18可分泌吩嗪-1-羧酸PCA，有效抑制黄瓜枯萎病菌及多种植物病原菌菌丝的生长[35]。本研究中菌株YS05扩增到含有编码吩嗪-1-羧酸和硝吡咯菌素等合成基因，结合菌株全基因组测序结果，使用antismash比对发现该菌株有18个次生代谢物合成基因簇（数据未发表），从基因层面上解释了该菌株可有效抑制多种病原菌的原因。

目前，微生物挥发性物质的研究仍处于发展阶段，郭洁心等[36]利用平板对扣法测定解淀粉芽胞杆菌XJ5挥发性化合物可有效抑制苹果褐腐病菌Monilinia fructigena等多种病原菌病斑扩展和菌丝生长；杨艺炜等[37]从土壤样品中筛选出一株绿针假单胞菌 XF10，其挥发性代谢产物可有效抑制烟草黑胫病菌菌丝的生长；冯福山等[38]测定枯草芽胞杆菌4种挥发性化合物对油茶病原真菌均具有较好的抑菌活性，抑菌活性壬醛＞苯甲醛＞3-甲基-4-苯基吡唑＞苯丙噻唑。本研究采用二分皿法测定了绿针假单胞菌桔黄亚种 YS05挥发性物质对 8种病原菌的抑制效果，均具有一定的抑制效果，后续将采用顶空固相微小萃取技术（HS-SPME）和气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）对其挥发性物质成分进行分析，为该菌株的开发提供理论依据。

番茄匍柄霉叶斑病由于其发病机制和宿主抗病机理不明确[39]，缺乏抗性基因和有效的化学防治措施[40]，给农户造成了严重的损失。生物防治由于绿色无污染、持效期长等特点而被广泛接受。李新宇等[15]测定枯草芽胞杆菌ZF161对番茄匍柄霉叶斑病盆栽防效达63.27%，本研究通过番茄离体叶片和活体盆栽试验测定绿针假单胞菌YS05对番茄匍柄霉叶斑病防治效果分别达到71.52%和58.27%，其中离体叶片防效均高于对照药剂，表明其具有良好的生防潜力。